一株酸性果膠酶產(chǎn)生菌的篩選及酶學(xué)特性分析

Screening and Enzymatic Characterization Analysis of an Acid Pectinase-Producing Bacteria

FUJinling，MA Mengyao，LANWeishen， ZENGLiqing，SUNJiaman，LI Shuai* （School of Chemistry and Environmental Science， Xiangnan University， Chenzhou 423oo0， China）

Abstract： In this paper， a strain of pectinase-producing bacteria was screened from the soil by Congo red method，and the enzymaticcharacteristics ofthe pectinase produced by pectin were studied.The results showed that afilamentous fungus with pectinase-producing ability was screened from the soil，and it was identified as Aspergilus niger after molecular biological identification. Under the conditions of 50^°C and pH=4.0 ， the pectinase enzyme activity produced by this bacterium was the best. When the pH value is 3.0 to 5.0， its stability is good.

Keywords： pectinase; Aspergillus niger; enzymatic properties

果膠酶來源豐富，植物、動物和微生物均具有果膠酶合成能力。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、真菌中均有可產(chǎn)果膠酶的菌種，不同來源的果膠酶在酶學(xué)特性上表現(xiàn)出較大差異。果膠酶是能降解果膠物質(zhì)的一類酶的總稱[1]，有酸性果膠酶和堿性果膠酶之分，這兩類酶是重要的工業(yè)酶，它們在多個領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。酸性果膠酶主要應(yīng)用于食品行業(yè)，如蔬果汁的榨汁與澄清、釀酒、天然成分的提取[2-3]。

近年來，人們在工業(yè)生產(chǎn)中更加注重低成本、低污染、低耗能，生物酶制劑因具有用量少、專一性高、催化效率高、活性可調(diào)節(jié)性強以及天然環(huán)保等特點在工業(yè)應(yīng)用中逐漸顯現(xiàn)出優(yōu)勢。因此，本文從自然界中篩選出一株果膠酶產(chǎn)生菌，并探究其所產(chǎn)果膠酶的酶學(xué)特性，以期為果膠酶的生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

學(xué)院食堂周邊的土壤果膠、半乳糖醛酸、剛果紅、苯酚、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、3，5-二硝基水楊酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸、氯化鉀、氯化鈣等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（AUY220），日本島津公司；高壓滅菌鍋（SX-500），日本TOMY公司；超凈工作臺（CJ-10），天津市泰斯特儀器有限公司；分光光度計（A380），翱藝儀器（上海）有限公司；振蕩培養(yǎng)箱（BSD-250），上海博迅實業(yè)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：果膠 2.0g 、 K₂HPO₄1.0g 、MgSO₄?7H₂O0.5g 、 NaNO₃3.0g 、 FeSO₄?7H₂O0.01g 瓊脂粉 20.0g 、剛果紅 0.4g 、蒸餾水 1.0L ， pH=7.0 。

活化培養(yǎng)基：馬鈴薯 200.0g 、瓊脂粉 15.0g 葡萄糖 20.0g 、蒸餾水 1.0L ， pH 值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：果膠 4.0g 、馬鈴薯 200.0g 、葡萄糖 20.0g 、蒸餾水 1.0L ， pH 值自然

1.4 實驗方法

1.4.1果膠酶產(chǎn)生菌的初篩

稱取 5g 土壤樣品于裝有 50mL 無菌水的錐形瓶中， 30^qC 下振蕩 48h ，吸取土壤上清液得到菌懸液。采用濃度梯度稀釋法稀釋菌懸液，取稀釋后的菌懸液 200μL 涂布于初篩培養(yǎng)基平板。 30^qC 下培養(yǎng) 5～ 7d后，篩選出可產(chǎn)生水解圈的菌株，用于后續(xù)復(fù)篩。

1.4.2 果膠酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基， 30°C 下振蕩培養(yǎng) 72h ，取發(fā)酵液于4 C 、 5000r?min^-1 離心 5min ，取上清液得到粗酶液。采用二硝基水楊酸（3，5-Dinitrosalicylicacid，DNS）法測定各菌株的果膠酶活力，選擇酶活力最高的菌株作為目的菌株，用于后續(xù)的果膠酶酶學(xué)特性研究。

1.4.3 果膠酶活力的測定

果膠酶活力測定采用DNS法[4]，步驟如下。

（1）半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。取14支比色管，按表1加入試劑，混勻后，沸水浴 10min ，立即用冷水冷卻；待充分冷卻后，加水定容至 25mL 以1號管為對照測 540nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）果膠酶活力測定。取 4mL 緩沖液（ pH=5.0 ）、1mL 果膠底物、 1mL 經(jīng)適當(dāng)稀釋的粗酶液于比色管中，以滅活的粗酶液為對照，搖勻后， 50^qC 下反應(yīng)30min. 。取 2mL 反應(yīng)液于另一支比色管中，并加入2mL 蒸餾水、 5mL DNS試劑，沸水浴 10min ，用流動水冷卻至室溫后，加蒸餾水至 25mL ，搖勻，于3000r?min^-1 離心 5min 。吸取上清，用分光光度計測 540nm 處的吸光度。

在一定條件下， 1mL 粗酶液每分鐘水解果膠生成 1μg 半乳糖醛酸為一個酶活力單位（ U?mL^-1 ）。酶活力的計算公式為

式中： P 為果膠酶活， U?mL^-1 ; m 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的半乳糖醛酸質(zhì)量， mg ; n 為粗酶液稀釋倍數(shù)； t 為反應(yīng)時間， min 。

1.4.4 菌株鑒定

待PDA培養(yǎng)基中的目的菌株長出白色菌絲后，將待測平板菌送至生工生物成都測序部進(jìn)行ITS測序。采用BLAST工具對測序結(jié)果進(jìn)行比對，并用MEGA11構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.5果膠酶的酶學(xué)特性研究

通過控制變量法，探究果膠酶的最適反應(yīng)溫度、pH 值，果膠酶的溫度、pH值穩(wěn)定性，以及金屬離子對酶活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1果膠酶產(chǎn)生菌的初步篩選結(jié)果

根據(jù)1.4.1項方法進(jìn)行果膠酶產(chǎn)生菌的初步篩選，共篩選出3株可產(chǎn)生明顯水解圈的果膠酶產(chǎn)生菌，水解圈直徑在 4.8～8.2mm 。詳見表2。

2.2半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。線性方程為y=0.501 7x-0.097 9 ，斜率 k 為0.5017， R² 為 0.9996 ，說明半乳糖醛酸濃度與吸光度之間具有較好的線性相關(guān)性，可用于酶活力計算。

2.3 果膠酶產(chǎn)生菌的復(fù)篩結(jié)果

根據(jù)1.4.3項方法測定3株果膠酶產(chǎn)生菌的酶活力，測得菌株A-1、A-2、A-3的酶活力分別為51.61，15.93，21.97UmL^-1 。菌株A-1的酶活力最高，故選擇該菌作為目的菌株，用于后續(xù)酶學(xué)特性研究。

2.4菌株鑒定結(jié)果

對目的菌株的ITS序列進(jìn)行測序，測得該菌的ITS序列長度為 567bp 。使用NCBI中的BLAST工具進(jìn)行ITS序列比對，結(jié)果顯示目的菌株與Aspergillusnigerstrain GZ-4（KT726919.1） 的相似性為 100% 。采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2所示。可以看出，目的菌株A-1與AspergillusnigerstrainGZ-4（KT726919.1）處于發(fā)育樹的同一支，表明目的菌株為黑曲霉（Aspergillusniger）

2.5果膠酶的酶學(xué)特性研究結(jié)果

2.5.1 最適反應(yīng)溫度

如圖3（a）所示，當(dāng)反應(yīng)溫度為 35～50^°C 時，果膠酶酶活力呈上升趨勢，且在 50^qC 達(dá)到峰值；當(dāng)溫度高于 50^qC 后，果膠酶的結(jié)構(gòu)被破壞，相對酶活力開始下降，說明該果膠酶屬于中溫酶。

2.5.2 最適反應(yīng)pH值

如圖3（b）所示，當(dāng)pH值為 3.0～4.0 時，相對酶活力逐漸上升，且在pH值為4.0時達(dá)到最大值;當(dāng)pH值大于4.0時，相對酶活力呈下降趨勢，說明該果膠酶屬于酸性果膠酶。該果膠酶的最適反應(yīng)pH值與文獻(xiàn)報道的真菌所產(chǎn)果膠酶的最適反應(yīng)pH值主要集中在 4.0～7.0 相符[5]。

2.5.3 果膠酶的溫度穩(wěn)定性

如圖3（c）所示，當(dāng)粗酶液在30、 40°C 下處理1h時，酶活力可以維持在原始酶活力的 80% 以上；當(dāng)處理溫度升高至 70% 時，果膠酶已失去活性，說明該果膠酶在 30～40^°C 下穩(wěn)定性較好，但不具有高溫耐受性。

2.5.4果膠酶的 pH 值穩(wěn)定性

如圖3（d）所示，當(dāng)粗酶液在pH值為3.0、4.0、5.0的條件下處理1h時，酶活力可以維持在原始酶活力的 80% 以上，說明該酶具有較好的酸穩(wěn)定性。

2.5.5金屬離子對果膠酶酶活力的影響

金屬離子對果膠酶活力的影響結(jié)果如圖4所示。可以看出， Cu²⁺ 對果膠酶酶活力具有顯著的促進(jìn)作用 ?plt;0.001 ），酶活力提高了約 80% ， Mn²⁺ 對果膠酶酶活力也具有顯著的促進(jìn)作用（ （plt;0.01 ）；K⁺ 、 Mg²⁺ 可顯著抑制果膠酶酶活力（ ）；Ca²⁺ 對果膠酶活力沒有明顯的作用效果。

3結(jié)論

本實驗從土壤中分離出一株能夠產(chǎn)生果膠酶的絲狀真菌，經(jīng)鑒定后確定該菌為黑曲霉（Aspergillusniger）。該菌所產(chǎn)果膠酶的最佳活性溫度為 50^qC ，最佳活性pH值為4.0;在 30～40°C?pH 值為 3.0～5.0 時，其穩(wěn)定性較好； Cu²⁺ 、 Mn²⁺ 可促進(jìn)果膠酶活力，K⁺ 、 Mg²⁺ 可抑制果膠酶活力， Ca²⁺ 則對果膠酶活力無明顯影響。

參考文獻(xiàn)

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