食品快速檢測(cè)中ELISA技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀與優(yōu)化策略

The Application Status and Optimization Strategies of ELISA Technology in Rapid Food Detection

JIANG Guigang （Xichang Food and Drug Rapid Inspection and Testing Station， Xichang 615ooo， China）

Abstract： Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） plays an important role in the field of rapid food detection due to its high sensitivitystrong specificity，and easyoperation.This article systematicallreviews the current application status ofELISA technology in the detection of food microorganisms，toxins，pesticide residues， and veterinary drug residues.It deeply analyzes the key problems it faces，including 1 positive/1 negative results，limitations indetectionrange，unevenqualityofreagent kits，and insuffcient professionallevelofoperators. Targeted optimization strategies are proposed， including using phage display technology to enhance antibody specificity， integrating microfluidic and massspectrometry technology to expand detection range， establishingan ISO 13485 standardized production system，and constructing a“theory practice quality control\"three inone training system，aiming to provide theoretical basis and technical path for improving the accuracyand applicabilityof ELISA technologyin food safetydetection.

Keywords： enzyme-linked immunosorbent assay; technologyrapid food testing; microorganisms; toxin; quality control

食品安全是國(guó)家公共衛(wèi)生工作的重點(diǎn)和熱點(diǎn)議題，直接影響到公眾健康和社會(huì)穩(wěn)定。隨著食品行業(yè)的不斷發(fā)展以及食品供應(yīng)鏈的日益復(fù)雜化，微生物污染、毒素、農(nóng)藥和獸藥殘留等問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，這對(duì)我國(guó)食品檢測(cè)技術(shù)提出了更高的要求。食品快速檢測(cè)技術(shù)作為一種保障食品質(zhì)量安全的重要手段，能夠在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)食品質(zhì)量與安全的檢測(cè)與篩查，為風(fēng)險(xiǎn)控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持[1]。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay，ELISA）

作為一種關(guān)鍵的食品快速檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，通過(guò)結(jié)合免疫反應(yīng)與酶的高效催化特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)食品中微量有害物質(zhì)的快速檢測(cè)[2。近年來(lái)，ELISA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌、毒素、農(nóng)藥和獸藥殘留等指標(biāo)的檢測(cè)，但同時(shí)也面臨檢測(cè)準(zhǔn)確性、檢測(cè)范圍等方面的限制。本文針對(duì)ELISA技術(shù)在食品快速檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并對(duì)其存在的問(wèn)題及可能的優(yōu)化方案進(jìn)行探討，以期為推動(dòng)該技術(shù)的發(fā)展與提高食品安全檢測(cè)水平提供參考。

1ELISA技術(shù)在食品快速檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

1.1微生物檢測(cè)

ELISA技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面展現(xiàn)出極高的效率。食源性致病菌對(duì)人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)檢測(cè)技術(shù)雖相對(duì)成熟，但檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要 2～5d 而ELISA技術(shù)突破了這一限制，能夠在 2～5h 完成檢測(cè)。例如，在沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7以及單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測(cè)中，ELISA試劑盒能夠有效識(shí)別食品中微量的食源性致病菌。在牛奶中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)中，ELISA檢出限為 ，為確保乳制品中的微生物安全提供了重要支持，為消費(fèi)者提供了更及時(shí)的安全保障。

1.2 毒素檢測(cè)

有害真菌毒素對(duì)消費(fèi)者健康的威脅極為顯著，而以ELISA技術(shù)為代表的檢測(cè)手段是精準(zhǔn)識(shí)別真菌毒素的關(guān)鍵工具[3]。在黃曲霉素、赭曲霉素、玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等多種真菌毒素的檢測(cè)中，ELISA技術(shù)發(fā)揮了不可或缺的作用。例如，在黃曲霉素 B₁ 的檢測(cè)中，其線性范圍為 0.25～ 5.00ng?mL^-1 ，靈敏度為 12.5pg ，檢測(cè)時(shí)間僅需 ^4h ，這一高效檢測(cè)方法不僅顯著縮短了檢測(cè)周期，還能夠及時(shí)判斷糧谷類等食品中是否含有黃曲霉素 ΔB₁ 超標(biāo)情況，從而有效阻斷問(wèn)題食品進(jìn)入市場(chǎng)流通階段，切實(shí)保障消費(fèi)者的食品安全。

1.3農(nóng)藥殘留檢測(cè)

在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，農(nóng)藥的廣泛施用致使農(nóng)藥殘留問(wèn)題成為食品安全領(lǐng)域的突出隱患。ELISA技術(shù)在這一領(lǐng)域表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)，能夠?qū)Τ輨⑾x(chóng)劑和殺菌劑等多種農(nóng)藥殘留進(jìn)行高效檢測(cè)。例如，在柑橘類水果中烯菌靈殘留的檢測(cè)實(shí)踐中，ELISA法的檢測(cè)限可達(dá) 5μg?g^-1 ；針對(duì)新鮮果蔬中氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑殘留的檢測(cè)，香蕉、番茄、桃等果蔬中胺甲萘及蟲(chóng)螨威的檢測(cè)限分別低至 2.0μg?g^-1 和8.0μg?g^-1 。此外，該技術(shù)具備樣品前處理簡(jiǎn)單的特性，可大幅減少檢測(cè)準(zhǔn)備時(shí)間，且分析耗時(shí)短，尤其適用于蔬菜產(chǎn)區(qū)、批發(fā)市場(chǎng)等場(chǎng)所的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查工作，能夠迅速識(shí)別出農(nóng)藥殘留超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品，防止其流入消費(fèi)終端。

1.4 獸藥殘留檢測(cè)

動(dòng)物性食品的養(yǎng)殖過(guò)程中用藥比較普遍，而用藥不當(dāng)極易導(dǎo)致獸藥殘留現(xiàn)象的產(chǎn)生。ELISA技術(shù)的出現(xiàn)為解決該問(wèn)題提供了有效手段，并已在磺胺類、氯霉素類、苯并咪唑類、同化激素類和 β- 受體激動(dòng)劑類等多種獸藥殘留檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。以鹽酸克倫特羅（瘦肉精）檢測(cè)為例，該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)血清中低至 0.5ng?mL^-1 、動(dòng)物組織中低至 0.5μg?kg^-1 、飼料中低至 5μg?kg^-1 的檢測(cè)限。這樣的低檢測(cè)限水平能夠精確地檢測(cè)出獸藥殘留情況，從而為動(dòng)物性食品安全提供了強(qiáng)有力的保障，有效維護(hù)了公眾飲食中肉類及其他動(dòng)物性食品的安全性。

2ELISA技術(shù)在食品快速檢測(cè)中存在的問(wèn)題

2.1 假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題

在ELISA的實(shí)際檢測(cè)中，假陽(yáng)性結(jié)果和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)會(huì)對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定影響[4。假陽(yáng)性出現(xiàn)的主要原因是由于非特異性吸光值的干擾和交叉反應(yīng)。在固相載體表面，樣品中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等均有可能與抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致較高的背景信號(hào)。同時(shí)，抗體與結(jié)構(gòu)相似的反應(yīng)物之間可能會(huì)發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。例如，在某些獸藥殘留檢測(cè)中，由于被測(cè)物之間的結(jié)構(gòu)較為相似，它們將會(huì)在某種程度上與特異性抗體發(fā)生一定程度的交叉免疫反應(yīng)，從而引起假陽(yáng)性檢測(cè)信號(hào)的放大。而假陰性的出現(xiàn)則主要是由于抗原抗體結(jié)合效率較低和檢測(cè)靈敏度的限制，當(dāng)被檢測(cè)樣品中目標(biāo)物的含量與檢出限接近或低于方法檢測(cè)水平時(shí)，微量抗原和抗體的結(jié)合可能因溫育條件與洗脫過(guò)程不充分而無(wú)法有效形成免疫復(fù)合物，從而導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)缺失。此外，在復(fù)雜的食品基質(zhì)中，存在一系列抑制性物質(zhì)（如酶抑制劑、抗氧化劑等），這類物質(zhì)容易抑制酶標(biāo)物的催化能力，阻礙酶標(biāo)記物發(fā)揮催化反應(yīng)的功能，進(jìn)而造成顯色反應(yīng)不明顯產(chǎn)生假陰性信號(hào)。上述情況均會(huì)對(duì)檢驗(yàn)工作的準(zhǔn)確性造成影響，可能導(dǎo)致食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估出現(xiàn)偏差，進(jìn)而影響執(zhí)法決策的科學(xué)性和有效性。

2.2 檢測(cè)范圍有限

對(duì)于現(xiàn)有的ELISA技術(shù)，其檢測(cè)對(duì)象仍存在較大的局限性。 ① 該技術(shù)主要針對(duì)已建立成熟檢測(cè)方法的經(jīng)典食源性致病菌、常規(guī)農(nóng)藥獸藥殘留類污染物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，而對(duì)于新型污染物（如微塑料）、未知毒素（如新發(fā)現(xiàn)的真菌毒素衍生物）以及大分子物質(zhì)（如轉(zhuǎn)基因蛋白片段），尚缺乏針對(duì)性的檢測(cè)方法和相應(yīng)的抗體開(kāi)發(fā)。這是由于ELISA技術(shù)對(duì)新型污染物具有較高的特異性要求，而傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)在制備高親和力抗體時(shí)效率較低。 ② 隨著食品工業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的推進(jìn)，新型食品加工技術(shù)（如高壓滅菌、基因編輯技術(shù)等）可能引入新的潛在危險(xiǎn)因子，但現(xiàn)有的ELISA試劑盒難以滿足對(duì)其快速篩查的需求。此外，食品污染成分之間以及試劑與試劑之間的抗體特異性及檢測(cè)條件存在差異，單一檢測(cè)平臺(tái)無(wú)法同時(shí)對(duì)多目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，從而進(jìn)一步限制了該技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中多組分的檢測(cè)應(yīng)用。

2.3 試劑盒質(zhì)量參差不齊

ELISA試劑盒產(chǎn)品質(zhì)量的不穩(wěn)定性是影響該方法應(yīng)用的重要因素。 ① 部分企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中未能嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化工藝流程，如抗原/抗體包被液的配制不當(dāng)、包被液中抗原/抗體濃度不足或暴露性不佳、酶聯(lián)標(biāo)記物制備過(guò)程不規(guī)范等，造成檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度不穩(wěn)定，甚至因酶活性下降或標(biāo)記效率低下而顯著降低檢測(cè)靈敏度。 ② 原材料的質(zhì)量控制亦是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。若包被緩沖液中含有雜質(zhì)或封閉劑未選用正確，易導(dǎo)致非特異性吸附增多，進(jìn)而使背景水平增高。此外，目前尚缺乏針對(duì)ELISA試劑盒的明確且統(tǒng)一的質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，這使得不同廠家的產(chǎn)品在靈敏度（檢出限波動(dòng)范圍可達(dá)數(shù)倍）、特異性（交叉反應(yīng)率表現(xiàn)差異較大）和批間穩(wěn)定性（批內(nèi)變異系數(shù) gt;15% ）等方面存在較大差距。某些廠家為節(jié)約成本，采用劣質(zhì)原材料或簡(jiǎn)化質(zhì)量控制流程，進(jìn)一步加劇了產(chǎn)品質(zhì)量的不一致性，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性和可比性造成了嚴(yán)重影響。

3ELISA技術(shù)在食品快速檢測(cè)中的優(yōu)化策略

3.1降低假陽(yáng)性和假陰性率的優(yōu)化策略

關(guān)于假陽(yáng)性、假陰性問(wèn)題，針對(duì)ELISA技術(shù)本身，應(yīng)從抗體構(gòu)建、檢測(cè)方法完善和增強(qiáng)信號(hào)3個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。在抗體構(gòu)建方面，可運(yùn)用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建抗體的單鏈抗體片段，并借助計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)構(gòu)建抗體制備的可變區(qū)序列，從而降低結(jié)構(gòu)類似物引起的交叉反應(yīng)；研制雙功能抗體或抗體復(fù)合物，借助兩個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)增強(qiáng)檢測(cè)的專一性。在檢測(cè)過(guò)程優(yōu)化方面，可運(yùn)用微流控芯片進(jìn)行自動(dòng)化高精度調(diào)控反應(yīng)，適當(dāng)調(diào)整溫育條件（如設(shè)置多梯度溫度）、洗滌參數(shù)（如動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)壓力變化）等，以提升抗原-抗體復(fù)合體形成的速度，降低非特異性吸附率；應(yīng)用納米物質(zhì)（如納米金、量子點(diǎn)）制造新的信號(hào)放大平臺(tái)，將檢測(cè)限提升 1～3 個(gè)數(shù)量級(jí)，緩解低濃度目標(biāo)物的漏檢現(xiàn)象。綜合上述技術(shù)手段，能夠大幅降低假陽(yáng)性率和假陰性率，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

3.2拓展檢測(cè)范圍的技術(shù)創(chuàng)新路徑

為解決ELISA技術(shù)檢測(cè)范圍局限性的問(wèn)題，應(yīng)從抗體研發(fā)和“組合技術(shù)”兩個(gè)層面協(xié)同推進(jìn)。在抗體研發(fā)方面，利用合成生物學(xué)構(gòu)建全人源抗體庫(kù)，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序聯(lián)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法快速篩選出針對(duì)新型污染物（如微塑料添加劑、基因編輯產(chǎn)物）的特異性抗體；開(kāi)發(fā)適體-抗體融合適用體聯(lián)合檢測(cè)體系，利用適體對(duì)小分子的高親和力特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)未知毒素的高通量富集，進(jìn)而通過(guò)與抗體結(jié)合提高對(duì)未知毒素的檢測(cè)適用性。在技術(shù)層面，將ELISA與表面增強(qiáng)拉曼光譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用相結(jié)合，構(gòu)建“ELISA初篩－質(zhì)譜確證”的綜合檢測(cè)體系[5]。例如，用微流控芯片將ELISA與表面增強(qiáng)拉曼光譜原位聯(lián)用，可在 15min 內(nèi)完成多毒素的定性篩查，并進(jìn)一步借助液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中新型污染物的高通量、高準(zhǔn)確性檢測(cè)，大幅拓寬該技術(shù)的應(yīng)用范圍。

3.3提升試劑盒質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)

健全試劑盒質(zhì)量控制流程是改善產(chǎn)品質(zhì)量良不齊問(wèn)題的關(guān)鍵舉措。應(yīng)制訂科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)男袠I(yè)生產(chǎn)規(guī)范，明確抗原抗體包被操作參數(shù)（如包被量、pH值、時(shí)長(zhǎng)）、酶標(biāo)記物活力檢驗(yàn)參數(shù)（如比活力、標(biāo)記度）、原材料質(zhì)控參數(shù)（如緩沖液純度、封閉液成分）。同時(shí)，企業(yè)需通過(guò)醫(yī)療器械質(zhì)量管理體系（ISO13485）認(rèn)證，以確保質(zhì)量管理符合國(guó)際規(guī)范。此外，應(yīng)構(gòu)建健全全生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量可追溯機(jī)制，對(duì)產(chǎn)品原材料獲取、生產(chǎn)制作、成品檢測(cè)等流程進(jìn)行質(zhì)量自動(dòng)化、數(shù)字化的控制，保證每批次產(chǎn)品的可溯源性。為進(jìn)一步提升產(chǎn)品質(zhì)量，建議完善獨(dú)立第三方實(shí)驗(yàn)室的盲樣對(duì)比評(píng)價(jià)機(jī)制，基于敏感度（檢出限變異系數(shù) ?10% ）、專一性（交叉反應(yīng) lt;5% ）、批次穩(wěn)定性（變異系數(shù) lt;12% ）等關(guān)鍵指標(biāo)建立多因素綜合評(píng)估方案。通過(guò)政府監(jiān)督與行業(yè)自律相結(jié)合的方式，推動(dòng)企業(yè)引入自動(dòng)化生產(chǎn)流程以及智能化質(zhì)控設(shè)施，從根本上保障試劑盒產(chǎn)品的質(zhì)量。

4結(jié)語(yǔ)

ELISA是食品快速檢測(cè)中的重要技術(shù)之一，其在傳統(tǒng)檢測(cè)體系中的應(yīng)用已趨于成熟，有效改善了風(fēng)險(xiǎn)篩查的工作效率和準(zhǔn)確率。然而，隨著食品安全風(fēng)險(xiǎn)的復(fù)雜性增加及未知風(fēng)險(xiǎn)挑戰(zhàn)的不斷涌現(xiàn)，傳統(tǒng)方法在準(zhǔn)確率、覆蓋范圍和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用方面逐漸顯現(xiàn)出不足之處，難以完全滿足當(dāng)前需求。因此，有必要通過(guò)融合其他技術(shù)手段，并結(jié)合食品全生命周期的質(zhì)量監(jiān)管加以改進(jìn)。未來(lái)，應(yīng)以抗體工程技術(shù)和納米生物技術(shù)為核心，開(kāi)發(fā)特異性識(shí)別元件及新型傳感信號(hào)放大體系，同時(shí)借助合成生物學(xué)技術(shù)與智能檢測(cè)平臺(tái)相結(jié)合，優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)以及提高檢測(cè)人員能力，最終推動(dòng)ELISA技術(shù)在食品安全監(jiān)測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。

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