基于斑馬魚模型的化合物lignicol促血管生成活性研究

LiuChangyu1，LiJiaxun1，Wang Cong2，LiXiaobin1，ZhangYun1，andLiPeihail （1Biology Institute，Qilu UniversityofTechnology （Shandong Academy of Sciences），Ji'nan250103; 2School ofChemistry andChemical Engineering，GuangxiMinzu University，Nanning

AbstractObjectiveTo preliminarily explore the pro-angiogenic activity and mechanism of action of lignicol， based onthe zebrafish vascular injury model.MethodsVatalanib （PTK787） was used to incubate zebrafish embryos （24hpf） to construct a vascular injury zebrafish model，and they were exposed to lignicol atconcentrations of 5，10， and for 24h .Ferulic acid was used as a positive control to observe and calculate the vascular growth of zebrafish intersegmental and subintestinalvein vessels.The transcription levels of genes related to vascular growth in each group of zebrafish were determined using RT-PCR technology. ResultsCompared with the PTK787 model group，both the ferulic acid positive control group and Lignicol sample groups showed an increase in the length and numberof intersegmental vessls，as wellas the lengthof the subintestinal vein in zebrafish.Compared with the model group，lignicol （5，10， and ）significantly increased themRNA expressionlevelsof related genesinthevascular endothelial growth factor pathway，includingvegf，vegfa，vegfc，vegfR2，erk2，akt，raf，pkband plcY. ConclusionThis study explores the pro-angiogenic effect and mechanism of compound lignicol through a Vascular injury zebrafish model for the first time.It was found that lignicolhas significant pro-angiogenic activityat concentrations of 5，10， and . The mechanism might raise the transcription levels of related genes in the VEGF signaling pathway，promote the proliferation and migration of endothelial cels，and thus increase the length and number of blood vessels.This study laid the foundation for the application development ofcompound lignicol.

KeywordsLignicol; Zebrafish; Proangiogenic; Mechanism

血管生成是指在原有的血管結構基礎上產生新血管的過程，該過程會受到多種誘導因子和抑制因子交互影響[1]。正常的情況下，促血管生成因子和抑制因子處于一種動態平衡，一旦這種動態平衡被打破，就會引起疾病[2]。在血管生成的進程中，新血管的生成有助于恢復缺血性組織的氧氣供應，進而改善缺血心肌的血液供應狀況[3]。相反，當血管的功能發生障礙時，就會引起神經缺損、高血壓和腦缺血性中風等疾病4。于機體而言，血管承擔著為所有器官和結構提供養分供應的關鍵職責，并且能夠對氧氣和營養的供應進行精準調控，使其始終維持在動態平衡狀態[5]。目前，我國人口老齡化程度逐漸加深，與之相伴的是，心血管疾病的發病幾率也同步上升，由于心血管疾病的發生與血管的健康狀況密切相關，而促進血管生成藥物有望改善血管功能、增加血管數量，從而緩解心血管疾病，所以研發此類藥物具有極為關鍵的意義。

天然產物活性成分一般是指從動植物和微生物中提取獲得的具有獨特生物功能的化合物，可作為藥物開發的源泉，已批準藥物中大約有 60% 是天然產物或其衍生物[7-8]?；诨钚蕴烊划a物的研究已經發現了在心血管疾病、代謝性疾病和炎癥反應中具有生物活性和制藥應用的分子[9-12]。斑馬魚因體積小，繁殖能力強，發育快，易于觀察，并且表現出與人類的高度同源性等特點[13-14]，在藥物研發中展現出獨特的優勢?；衔飈ignicol初次從子囊菌Scytalidiumlignicola中被發現[15]，目前對該化合物的活性研究還較少。本實驗利用PTK787誘導血管損傷的斑馬魚模型，首次探究lignicol對斑馬魚體節間血管和腸下靜脈血管生長情況的影響及其作用機制。

1化合物lignicol的分子結構

本研究中，化合物lignicol（圖1）是從小葉海金沙內生真菌Spegazziniasp.MDCW-573的次級代謝產物中分離的一種異香豆素類化合物[16]，分子式為C₁₁H₁₂O₆ ，分子量240.21。

2材料與儀器

2.1樣品和試劑

化合物lignicol（純度約 95% 由廣西民族大學王聰副教授提供，現保存于山東省科學院生物研究所斑馬魚藥物篩選實驗室。

Vatalanib（PTK787）購自上海源葉生物科技有限公司，利用二甲亞礬（DSMO）溶解，配成 0.2mg/mL 母液，存于 -20°C 備用。鏈酶蛋白酶E、阿魏酸購自濟南博一生物科技有限公司，其中鏈酶蛋白酶E是通過去離子水溶解，配制為 1mg/mL ，現用現配；阿魏酸是通過DSMO溶解，配成20mmol/L母液，存于 備用。RNA提取試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

2.2 儀器

FSX100奧林巴斯倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；實時熒光定量PCR儀（美國Roche公司）；斑馬魚養殖飼養設備（北京愛生科技公司）。

3方法

3.1斑馬魚胚胎準備

Tg（flk1：EGFP）雌雄斑馬魚（斑馬魚由山東省科學院生物研究所孵育）分開喂養，照明 14h/ 黑暗 10h 交替進行，定時喂以人工顆粒狀餌料和剛孵出的鹵蟲無節幼體（Artemianaupli）。采卵時取健康性成熟的斑馬魚按雌雄2：2的比例放入交配缸內，次日8時30分抽板交配，10時獲得受精卵。對受精卵進行消毒和洗滌后移入斑馬魚胚胎培養用水（含 5.0mmol/L NaCl，0.17mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl₂ ， 0.16mmol/mL MgSO₄） 中， 28°C 下控光培養。

3.2化合物lignicol安全性濃度測定

將Tg（flk1：EGFP）斑馬魚幼魚隨機分成空白對照組、lignicol樣品組（ 5，10，20μmol/L） ，每組3個平行孔，每孔10條。向空白對照組中加入 2mL 的胚胎培養水，lignicol樣品組中分別加入 2mL 的培養水和lignicol化合物（5， 10，20μmol/L ，在 28°C 恒溫培養箱中培養 ^72h ，每天在顯微鏡下觀察計數。

3.3促進斑馬魚節間血管生成的活性評價

將受精后發育24h（hpf，hourspost fertilization）的斑馬魚胚胎用鏈酶蛋白酶E進行脫模，隨機分為6組，組別設計參考已有研究，分為空白對照組、模型組、陽性對照組和3個濃度樣品組[17-18]，置于24孔板，每組3個平行孔，每孔10枚胚胎。模型組、陽性對照組、樣品組分別給予PTK787 0.2μg/mL DMSO溶解），陽性對照組給予阿魏酸 DMSO溶解）[18-19]，樣品組給予化合物樣品（5、10和 ，DMSO溶解），加培養水至 2mL 后，置于 的恒溫光照培養箱讓胚胎繼續發育。24h后將斑馬魚置于熒光顯微鏡下觀察斑體節間血管生長狀況。利用imagepro-plus軟件測定斑馬魚節間血管的長度[20]和數量[21]。

3.4促進斑馬魚腸下靜脈血管生成的活性評價

將發育至72hpf的斑馬魚，隨機分為6組，即空白對照組、模型組、陽性對照組和樣品組，置于24孔板，每組3個平行孔，每孔10條斑馬魚。模型組、陽性對照組、樣品組分別給予] PTK787（0.2μg/mL） ，陽性對照組給予阿魏酸 4 0 ＼ ＼mathrm ＼ ，樣品組給予化合物樣品（5、10和 20μmol/L， ，加培養水至 2mL 后，置于 恒溫光照培養箱讓胚胎繼續發育。24h后將斑馬魚置于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚腸下靜脈血管的生長狀況。利用imagepro-plus軟件測定斑馬魚腸下靜脈血管長度[20]。

3.5實時熒光定量PCR測定血管生成相關基因的mRNA水平

在促進斑馬魚節間血管生成實驗中，將給藥后的48hpf斑馬魚用ddHO清洗3次，吸干水分，利用試劑盒FastPureCell/TissueTotalRNAIsolationKit-BOX2提取RNA，將各組樣本RNA逆轉錄得到cDNA，采用BIO-RADCFX96實時系統測定與血管生成相關基因的表達量，分4個重復進行。

實時定量PCR擴增反應條件為 95^°C 預變性30s1個循環后， 95°C 變性 10s ， 60^°C 退火 30s ，循環40次，最后 95°15s ， 60°60s ， 95°15s1 個循環，采集熒光信號。以rpl13a為內參對結果進行相對定量分析。 2^-ΔΔCt 方法被用來量化與血管相關基因的相對表達，所有基因的引物序列見表1。

3.6數據處理與分析

使用GraphPadPrism10軟件進行數據統計與分析，采用單因素方差分析檢驗進行差異顯著性分析， Plt;0.05 表示差異顯著。 Plt;0.01 表示差異極顯著

4結果

4.1化合物lignicol

安全性濃度測定如圖2所示，lignicol樣品組（5、10和 在 72hpf 時孵化率為 100% ，死亡率為0，無畸形，與空白對照組完全一致，這表明化合物lignicol在濃度為5、10和 20μmol/L 時對斑馬魚胚胎發育無毒性，選用此濃度開展后續試驗。

4.2化合物lignicol對斑馬魚節間血管生成的影響

從圖3可以看出，模型（PTK787）組斑馬魚的節間血管長度和數量與空白對照組相比顯著降低（ P lt;0.01? ，節間血管生成受到顯著抑制，而陽性藥（阿魏酸）組的斑馬魚節間血管長度和數量與模型組相比顯著增加 （Plt;0.01） ，表明斑馬魚節間血管損傷模型制備成功。與模型組相比，化合物樣品（5、10和20μmol/L 組的斑馬魚節間血管長度和數量顯著增加 （P lt;0.01） ，因此lignicol具有促進節間血管生成的活性。

4.3化合物lignicol對斑馬魚腸下靜脈血管生成的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，模型（PTK787）組斑馬魚的腸下靜脈血管長度顯著降低 （Plt;0.01） ，而陽性藥（阿魏酸）組的腸下靜脈血管長度與模型組相比顯著增加 （Plt;0.05） ，表明斑馬魚腸下靜脈血管損傷模型制備成功。與模型組相比，5、10和 的樣品組腸下靜脈血管長度明顯增加，表明lignicol

注：A為斑馬魚的熒光顯微圖像；B為節間血管長度；C為節間血管數量；與空白對照組相比， ^##Plt;0.01 ；與模型組相比， ^*Plt;0.05 ^**Plt;0.01 ；FA指的是阿魏酸Ferulicacid（FA， 40μmol/L ，紅色框為斑馬魚節間血管計數范圍：白色箭頭所指為節間血管。

注：與空白對照組相比， ^##Plt;0.01 ；與模型組相比， ^*Plt;0.05 ^**P lt;0.01 ；FA指的是阿魏酸Ferulicacid（FA， ，白色箭頭所指為腸下靜脈血管。

對斑馬魚腸下靜脈血管生成具有促進作用。

4.4化合物lignicol對斑馬魚血管生成相關基因表達 水平的影響

實驗結果（圖5）表明，與空白對照組相比，模型（PTK787）組斑馬魚中的基因vegf、vegfa、vegfc、vegfR2、erk2、akt、raf、pkb和plcγ的mRNA表達量明顯降低 （Plt;0.05） 。與模型組相比，5、10和 化合物樣品組基因vegf、vegfa、vegfc、erk2和akt的mRNA表達量顯著增加 （Plt;0.05） ，樣品組基因vegfR2（20 （5μmol/L） 、raf（5和 、 pkb（20μmol/L） 小plcy（10和 表達量也顯著增加 （Plt;0.05） 。綜上，化合物lignicol是通過上調vegf、vegfa、vegfc、vegfR2、erk2、akt、raf、pkb和plcγ基因激活MAPK通路和PI3K/AKT通路發揮促血管生成活性的。

5討論

心血管病是影響我國國民健康的重大疾病，已有證據表明該病的發生與血管生成不足密切相關[22]。目前在臨床上已經有細胞因子、基因和干細胞治療等促進新血管網絡形成的方法，但這些方法存在副作用強、療效短暫、成功率低等問題[21-22]。因此，尋找高效低毒的促血管生成藥物是心血管病防治的迫切需求。藥物的發現需要借助血管生成模型，常見的血管生成模型有內皮細胞、雞胚絨毛尿囊膜、斑馬魚和爪蟾蝌蚪模型等[20]。其中斑馬魚因其產卵多、發育周期短、胚胎透明等優點，可以通過轉基因熒光標記血管在活體胚胎中直接觀察樣品對其血管系統的影響，已成為血管功能分子篩選與評價的重要藥物篩選模型[20-21]。

植物內生真菌是一類生長在宿主植物體中而不引起明顯病害現象的共生真菌，可以產生生物活性物質，保護宿主免受外部脅迫的影響，增強宿主在環境中的生存競爭力[16]。植物內生真菌是結構新穎、活性獨特化合物的重要來源，自前已從中發現具有抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性的酚類、醌類、萜類、生物堿等天然產物[25-28]。化合物lignicol來源于小葉海金沙內生真菌Spegazzinia sp.MDCW-573，在心血管保護方面還未見有相關報道。本研究利用轉基因斑馬魚血管模型首次發現了化合物lignicol具有促血管生成活性，并對其作用機制進行了初步探究。通過PTK787誘導轉基因斑馬魚的血管損傷，模型組斑馬魚節間血管的長度、數量和腸下靜脈血管的長度與空白對照組相比顯著減少，表明造模成功。與模型組相比，化合物樣品組斑馬魚節間血管的長度、數量和腸下靜脈血管的數量均顯著增加，表明化合物lignicol在濃度為5、10和20μmol/L 時具有促血管生成活性。

血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）在生理和病理狀態下對血管屏障功能的調節起著重要作用，是血管生成和血管功能維持的核心調控因子[29-30]。相關研究表明，VEGF通過激活血管內皮生長因子受體1或2（vascularendothelialgrowth factor receptor1or2，VEGFR1 orR2）誘導內皮細胞信號傳導，進而發揮血管生成調控作用[31]。在斑馬魚中，原發性血管生成受VEGFA調控，在動脈血管生成中，VEGFA還能促進磷脂酶Cγ（PhospholipaseCγ，PLCγ）信號表達，次生血管生成則受VEGFC調節[32]。PLCγ通路被激活后，通過三磷酸肌醇（IP3）/甘油二酯（DAG）介導的信號轉導，可促使內皮細胞進入細胞周期，加速細胞分裂和增殖，為血管生成提供足夠的細胞數量[33]。快速加速纖維肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）蛋白激酶和細胞外信號調節激酶2（extracellular signal-regulatedkinase2，ERK2）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，參與RAS-RAF-MEK-ERK信號轉導級聯，激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，可以促進血管內皮細胞增殖[34-35]。Akt/PKB也是一類在細胞信號傳導中起關鍵作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與PI3K/Akt信號通路，可以促進血管內皮細胞的生存和遷移[36]。本實驗對血管內皮細胞增殖和遷移相關信號通路中的基因（vegf、vegfa、vegfc、vegfR2、akt、raf、erk2、plcγ和pkb）表達量進行了檢測，結果顯示，與空白對照組相比，模型組的各基因表達量均顯著降低，而化合物樣品組的各基因表達量與模型組相比顯著增加，表明化合物lignicol可能是通過上調這些基因激活MAPK通路和PI3K/AKT通路而發揮促血管生成活性的。綜上所述，本研究利用PTK787誘導的斑馬魚血管損傷模型首次發現了化合物lignicol在5、10和 濃度時具有促血管生成活性，同時推測其可能是激活MAPK通路和PI3K/AKT通路，誘導血管內皮細胞增殖和遷移，促進血管生成。該研究為化合物lignicol的深入拓展奠定基礎，也為植物內生真菌天然產物資源的開發利用提供了新思路。

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