椎間盤退行性變中髓核細胞差異表達和功能富集分析

中圖分類號：R681.53 文獻標識碼：A 文章編號：1673-260X（2025）06-0044-05

椎間盤退行性變（intervertebraldiscdegenera-tion，IDD）是導致慢性腰痛的主要原因之一。然而，導致椎間盤退行性變的病因復雜多樣，其危險因素和具體的作用機制尚不完全明確[1。既往嚴重的椎間盤疾病常采取手術治療，而早、中期的椎間盤退變尚無確切、有效的治療手段。目前，IDD可以根據患者的癥狀選擇保守治療或手術治療。然而，這些都只能緩解疼痛，而不能逆轉IDD并重建脊柱的機械功能2。椎間盤（IVD）由內髓核（NP）和外纖維環（AF）組成，作為脊柱的承重和緩沖單位。NP細胞位于內盤中，主要作用是產生和維持細胞外基質（ECM）。普遍認為，IDD進展是由NP細胞的耗竭和ECM的降解引發和加速的。IDD的發病與髓核細胞的功能障礙或喪失密切相關4。最新的研究方向正朝著生物治療領域發展，比如通過調控RNA的表達、利用間充質干細胞治療等。深入探究椎間盤退變的分子生物學機制及其危險因素，對椎間盤退行性疾病的預防、診斷、早期治療和后期康復均有重要意義。本研究通過生物信息學方法進行分析，探討椎間盤退行性變髓核細胞中基因表達的相關機制，旨在為治療椎間盤退行性變提供新思路，也為椎間盤退行性變臨床治療提供參考。

1材料與方法

1.1 采集數據

從Gene Expression Omnibus（GEO）數據庫獲取椎間盤退行性變微陣列數據集GSE56081，GSE63492，GSE67566，數據集樣本來源為人髓核細胞。GSE63492為miRNA的數據，GSE56081為mRNA和lncRNA的數據，GSE67566為circRNA的數據。

1.2篩選差異基因

使用R軟件\"limma\"包進行差異分析，差異分析的篩選標準在GSE56081中為adj ?p -value值小于 ^0.05，logFC 的絕對值大于1;在GSE63492中為p -value值小于0.05，由于數量較少不對logFC進行篩選；在GSE67566中為adj ?p -value值小于0.05，logFC的絕對值大于1。

1.3差異基因的功能富集分析

使用R軟件“clusterProfiler\"包對差異基因進行富集分析，選取的差異基因是數據GSE56081中protein-coding的部分。富集分析的條件為minGS-Size=2， p -value值為0.05。

1.4差異基因的相關性及相關通路

從數據GSE56081中選取mRNA和lncRNA，使用R軟件“Hmisc”包計算mRNA和lncRNA，miRNA及circRNA的相關性，選取其中 p -value值小于0.05，并且相關性大于0.9的作用對。通過Cy-toscape軟件對mRNA、lncRNA、miRNA以及cir-cRNA的相關性進行繪圖，使用“cytoHubba\"的算法獲得相關性作用網絡中核心的前20個點，提取其中的miRNA、lncRNA以及circRNA并對其相關基因再次進行GO/KEGG富集分析。

2實驗結果

2.1差異基因獲取結果

對芯片的基因表達數據進行處理，分析得到GSE56081中有基因22559個，篩選出差異基因14887個，其中protein-coding的基因有742個，lncRNA有148個，火山圖見圖1A;GSE67566中circRNA有2894個，差異基因有636個，火山圖見圖1B；GSE63492中去除表達缺失的miRNA，有miRNA92個，其中差異基因為40個，熱圖見圖1C。

2.2 差異基因富集分析

使用R軟件“clusterProfiler\"包對差異基因進行富集分析，GO富集分析結果顯示，差異基因主要集中在自噬調節、PI3K信號通路和對內質網應激的反應等生物學進程，含膠原蛋白的細胞外基質、膜筏和核糖體亞基等細胞組分以及GTP酶激活蛋白和蛋白激酶抑制因子等分子功能。KEGG富集結果顯示，差異基因顯著富集于類風濕性關節炎和TNF信號通路等通路，富集圖見圖2。

2.3差異mRNA與miRNA、lncRNA以及circRNA的相關性

使用R軟件“Hmisc”包計算mRNA與miR-NA、lncRNA以及circRNA的相關性，使用的方法為 spearman，選取其中相關性大于0.9 的相互作用對，共獲得25816個作用關系。將其代入Cy-toscape，使用\"Hubba\"的算法獲得前10個核心的基因，見表1，計算方法為 MCC 10個核心的基因包括3個circRNA和7個lncRNA。3個circRNA為hsa_circRNA_103565、hsa_circRNA_103612、hsa_circRNA_103688，其相關的基因有307個，7個lncRNA 為 AC097110.1、AL121718.1、AL590787.1、LINC01299、LINC01411、NORAD、SNHG8，其相關的基因有324個。

2.4選取核心miRNA、lncRNA、circRNA相關的mRNA進行富集分析

對并集390個基因進行富集分析，見圖3。結果顯示，其參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、自噬調控、MAPK信號通路及TNF信號通路等。

3討論

生物信息學從廣義上講是利用數理和信息科學的觀點、原理和方法研究生命現象的一門學科，在生命科學的研究中發揮著至關重要的作用。我們利用生物信息學技術，通過獲取基因表達量和相關富集分析，對椎間盤退行性變進行分子機制研究。椎間盤退行性變作為骨科退行性疾病之一，是導致腰痛的主要原因，全球約 60%～80% 的人口患有這種疾病，給人類社會造成巨大的健康影響和經濟負擔。然而，IDD的分子機制仍不清楚，導致治療策略有限。IDD是一個復雜的過程，涉及壓力、炎癥、免疫、基因等多方面的因素

目前尚缺乏對椎間盤退行性變中髓核細胞生物信息學分析的相關研究。我們對椎間盤退行性變中髓核細胞與正常組比較差異表達基因進行GO富集分析，結果顯示這些基因大多數位于含膠原蛋白的細胞外基質、膜筏和核糖體亞基。這些差異基因參與生物學過程的機制是通過自噬調節等參與PI3K信號通路和對內質網應激的反應等過程。目前研究結果發現，內質網應激可能是椎間盤細胞自噬的重要誘發因素，且自噬作為椎間盤退行性變重要參與因素。這與我們在生物信息學分析中發現的自噬、內質網應激參與椎間盤退行性變過程具有一致性。自噬，是一種對細胞功能至關重要的細胞內存活機制，在生理條件下，自噬在細胞的基礎水平上運作，通過促進受損細胞成分的有序降解和回收來防止受損分子的積累。內質網（ER）是真核細胞中最大的細胞器。它在應激條件下激活保護機制，例如缺乏營養或氧氣，包括未折疊蛋白反應（UPR）ER相關降解（ERAD）和ER自噬[。在應激條件下，內質網自噬的主要功能是降解擴增的內質網膜以維持細胞質量和平衡[]。髓核（NP）細胞凋亡與椎間盤（IVD）中過度的內質網應激有關，這可能會加快IDD的進展。綜上，自噬可以通過保護髓核細胞來延緩IDD進展，臨床上可以通過人為干預自噬達到延緩IDD的目的[12]，但是并不是自噬亢進就會對髓核細胞有利。

KEGG富集分析顯示，差異基因主要富集于TNF信號通路、類風濕性關節炎和MAPK信號通路等通路中。其中TNF信號通路與IDD的發病機制密切相關。TNF- σ?α?α?α?α 在退行性IVD組織中高表達，深度參與椎間盤退化的多種病理過程，包括基質破壞、炎癥反應、細胞凋亡、自噬和細胞增殖。TNF- σ?α?α?α?α 表達增加不僅與椎間盤退化密切相關，而且被認為是該疾病的病因之一[13-16]。

研究發現，核心基因NORAD表達的條件敲除或敲低會導致多種有絲分裂錯誤，包括后期橋、有絲分裂滑移和顯著的非整倍體。在胃癌中，NORAD表達可通過氧化應激激活去調控細胞自噬[。Li等[18]研究證明通過 m6A 測序，lncRNANORAD在衰老髓核細胞（NPC）中甲基化顯著增加，同時NORADm6A 修飾或NORAD/PUMILIO/E2F3軸的中斷可以作為抑制NPC衰老和椎間盤退化發展的潛在治療靶點。核心基因SNHG8是新發現的lncRNA，屬于SNHG家族，SNHG家族是一組可以被加工成小核仁RNA并具有重要生物學功能的轉錄物。它可以通過調節SNHG8/miR-384/Hoxa13/FAM3A和miR-335/RASA1等多個分子軸以及 NF-κB 信號通路來影響動脈粥樣硬化、慢性腦缺血、急性痛風性關節炎、缺血性腦卒中和心肌梗死的發病機制[]。在心肌梗死的細胞模型中，它的表達會直接影響TNF-α 表達含量，從而影響TNF信號通路[2。我們發現在IDD中的mRNA、lncRNA、miRNA以及circRNA都顯示其與細胞自噬、TNF信號通路有關。后續篩選核心基因及相關基因也顯示與細胞自噬和TNF信號通路均有著密切聯系。

本研究存在一定的不足，僅從椎間盤退行性變中髓核細胞層面進行生物信息學分析，可能與臨床實際情況存在一些出入，還有待進一步的體外實驗和體內實驗驗證核心基因功能。同時，選取的數據集樣本量較少，在一定程度上限制了結論的穩定性。

4結束語

綜上所述，通過生物信息學分析證實，細胞自噬異常和TNF信號通路激活是IDD髓核細胞退變的關鍵驅動因素，蛋白激酶、細胞因子及關鍵非編碼RNA（如NORAD、SNHG8）可能成為干預椎間盤退行性變的潛在靶點。未來可嘗試通過靶向干預其相關信號通路如自噬和TNF信號通路，以恢復髓核細胞功能，減輕髓核細胞炎癥及炎癥因子的產生，作為防治椎間盤退行性變的新策略。

參考文獻：

[1]邱晨生，鄧念，相宏飛，等.椎間盤退變相關危險因 素的研究進展[].中華骨科雜志，2021，41（10）：654- 659.

[2]Xin J，Wang Y， Zheng Z，et al. Treatment of Intervertebral Disc Degeneration. Orthop Surg. 2022 Jul;14（07）：1271-1280.

[3]Liao Z，Luo R，Li G， et al. Exosomes from mesenchymal stem cells modulate endoplasmic reticulum stress to protect against nucleus pulposus cell death and ameliorate intervertebral disc degeneration in vivo. Theranostics. 2019 May 31;9 （14）： 4084-4100.

[4]楊建霞，孫鳳歧，陳偉國，等.Nrf2抑制氧化應激 在椎間盤退變中的研究進展[J/OL].中醫學報， 1-7[2024-10-20].

[5]Mi B， Liu G， Zhou W，et al. Identification of genes and pathways in the synovia of women with osteoarthritis by bioinformatics analysis. Mol Med Rep. 2018 Mar; 17（03）：4467-4473.

[6]Global Burden of Disease Study 2O13 Collaborators. Global， regional， and nationalincidence，prevalence，and years lived with disability for 3O1 acute and chronic diseases and injuries in 188 countries，1990-2013：a systematic analysisforthe GlobalBurdenof Disease Study 2013[]. Lancet， 2015，386（9995）：743-800.

[7]Zielinska N， Podgórski M， Haladaj R，et al.Risk factors of intervertebral disc pathology—a point of view formerly and today—a review U]. J Clin Med， 2021，10（03）：409.

[8]Ye W， Zhu W，Xu K， et al. Increased macroautophagy in the pathological process of intervertebral disc degeneration in rats. Connect Tissue Res. 2013;54（01）：22-8.

[9]邵文鶴，王想福，陳偉國，等.中醫藥干預NLRP3 炎癥小體治療椎間盤退變的研究進展[Ⅲ].中醫 學報，2025，40（02）：349-356.

[10]Liu S， Yao S， Yang H， et al. Autophagy： Regulator of cell death. Cell Death Dis. 2O23 Oct 4; 14（10）：648.

[11]Mochida K，Nakatogawa H. ER-phagy：selective autophagy of the endoplasmic reticulum. EMBO Rep. 2022 Aug 3;23（8）：e55192.

[12]王宜燦，張虎林，汪小敏，等.中藥促進髓核細胞 自噬延緩椎間盤退變的研究進展.頸腰痛雜 志，2023，44（04）：680-682.

[13]Wang C，Yu X，Yan Y，et al. Tumor necrosis factor- ∝ ：a key contributor to intervertebral disc degeneration. Acta Biochim BiophysSin （Shanghai）. 2017 Jan;49（01）：1-13.

[14]WangY，Che M，Xin J，et al. The role of IL1β and TNF-α in intervertebral disc degeneration.Biomed Pharmacother. 202O Nov; 131： 110660.

[15]Pan H，Li H，Guo S，et al. The mechanisms and functions of TNF-α in intervertebral disc degeneration. Exp Gerontol. 2023 Apr;174： 112119.

[16]Hong J，Yan J，Chen J，et al.Identifcation of keypotential targets for TNF- /TNFR1-related intervertebral disc degeneration by bioinformatics analysis. Connect Tissue Res. 2021 Sep; 62（05）：531-541.

[17]Wang J， Sun Y， Zhang X， et al. Oxidative stress activates NORAD expression by H3K27ac and promotes oxaliplatin resistance in gastric cancer by enhancing autophagy flux via targeting the miR-433-3p.Cell Death Dis.2021 Jan 18;12 （01）：90.

[18]Li G，MaL，HeS，etal.WTAP-mediated m6A modification of lncRNA NORAD promotes intervertebral disc degeneration. Nat Commun. 2022 Mar 18;13（01）：1469.

[19]Ghafouri-Fard S，Harsij A，Hussen BM，et al. A review on the role of SNHG8 in human disorders.PatholResPract. 2023 May;245：154458.

[20]Zhang Y，Bian Y. Long Non -Coding RNA SNHG8 Plays a Key Role in Myocardial Infarction Through Affecting Hypoxia -Induced Cardiomyocyte Injury. Med Sci Monit. 2020 Aug 9;26：e924016.