開心散改善阿爾茨海默病神經(jīng)炎癥的機制預(yù)測與驗證

關(guān)鍵詞 開心散；阿爾茨海默病；神經(jīng)炎癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；NF-κB信號通路

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是嚴重威脅人類健康的重大疾病。隨著全球人口老齡化程度的不斷加劇，AD的發(fā)病率逐年攀升，據(jù)估計，到2050 年，全球?qū)⒓s有1.52 億人罹患此病[1]。膽堿酯酶抑制劑（多奈哌齊、利斯的明）和N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑（美金剛）是臨床常用的AD治療藥物，但上述藥物作用機制單一，而AD病因復(fù)雜、發(fā)病機制尚未明確，故治療效果有限[2]。

目前，AD 發(fā)病機制涉及多種假說，如神經(jīng)炎癥假說、tau 蛋白過度磷酸化假說、β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）級聯(lián)假說等，其中神經(jīng)炎癥被認為是AD最關(guān)鍵的致病機制之一[3]。研究指出，持續(xù)的神經(jīng)炎癥可引發(fā)tau 蛋白過度磷酸化、Aβ聚集及膽堿能系統(tǒng)紊亂等病理改變，這一系列病理改變又可進一步加劇炎癥介質(zhì)的釋放，從而形成一個自我放大的正反饋循環(huán)，最終引發(fā)AD[4]。由此可見，抑制神經(jīng)炎癥可能是治療AD的重要前提。

中草藥因具有多成分、多靶點的作用特點，在防治AD方面獨具優(yōu)勢[5]。開心散（簡稱“KXS”）是沿用至今、療效確切且具有AD治療優(yōu)勢的經(jīng)典名方[2]。該方始載于唐代孫思邈的《備急千金要方》，由遠志、人參、茯苓、石菖蒲組方而成，主治好忘，具有安神、補氣、利濕化濁之功效，已被載入國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》[2]。臨床研究證實，KXS可通過降低血清和腦組織中的炎癥介質(zhì)水平而有效減輕神經(jīng)炎癥，從而緩解AD癥狀[6]，但其具體的抗炎機制尚未明確。基于此，本研究擬借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段，預(yù)測KXS 與AD神經(jīng)炎癥的潛在關(guān)聯(lián)，并通過分子對接和動物實驗來探討KXS改善AD神經(jīng)炎癥的潛在機制，為KXS的應(yīng)用及相關(guān)新藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SA201 型Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）、SpectraMax i3x 型全波長全自動多動能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）、PowerPac Basic 型電泳儀（美國Bio-Rad 公司）、Tanon-5200SF 型全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、Teksqray SQS-1000 型玻片掃描影像系統(tǒng)（深圳市生強科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

KXS組方藥材遠志、人參、茯苓、石菖蒲飲片（批號分別為230401、230201、F1218411、230501）均購自廣州至信中藥飲片有限公司，出廠鑒定均顯示為真品。

D-半乳糖（D-galactose，D-gal；批號C2202593，純度≥99%）、鹽酸多奈哌齊對照品（批號K2119303，純度≥98%）均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、尼氏染色溶液（批號分別為CR2211064、CR2206058）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒、化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號分別為091922230203、103122230302）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（貨號分別為BM0627、BA1054）均購自武漢博士德生物工程有限公司；兔抗Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）抗體、兔抗核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）抗體、兔抗白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體、兔抗胱天蛋白酶1（caspase-1，CASP1）抗體、鼠抗核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)序列和含熱蛋白結(jié)構(gòu)域受體3（nucleotide-binding domain leucinerichrepeat and pyrin domain-containing receptor 3，NLRP3）抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 二抗（貨號分別為19811-1-AP、80979-1-RR、66737-1-lg、22915-1-AP、68102-1-lg、RGAMOO1）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗磷酸化NF- κB p65（phosphorylated NF- κBp65，p-NF-κB p65）抗體（貨號為AF2006）購自江蘇親科生物研究中心有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性SD大鼠32 只，體重200～250 g，購自廣東維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2022-0063。所有大鼠均飼養(yǎng)于中科產(chǎn)業(yè)控股（深圳）有限公司SPF級實驗動物中心[相對濕度（50±10）%，溫度（23±2）℃，晝夜交替循環(huán)照明]，自由攝食、飲水，并適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。本實驗方案經(jīng)該公司實驗動物福利倫理委員會審核批準（編號202300167）。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 KXS活性成分的篩選及靶點預(yù)測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索人參、茯苓、石菖蒲的化學(xué)成分，以口服生物利用度≥30% 和藥物相似性≥0.18 為標(biāo)準篩選核心成分[7]。對于未被TCMSP數(shù)據(jù)庫收錄的遠志，本研究先通過文獻檢索確定其所含成分的準確結(jié)構(gòu)，再導(dǎo)入TCMSP 數(shù)據(jù)庫進行篩選。為了提高數(shù)據(jù)的完整性，本研究還利用了本草組鑒數(shù)據(jù)庫來補充檢索組方藥材的化學(xué)成分，并通過PubChem數(shù)據(jù)庫檢索其簡短有機分子結(jié)構(gòu)式（simplified molecular input line entrysystem，SMILES），將SMILES導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫，按照“類藥性五原則”篩選核心成分[8]。將上述所得成分去重、合并，共得104 個核心成分。

借助SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫，以可能性≥0.1為標(biāo)準篩選上述核心成分的靶點[9]，共得970 個核心成分靶點。

2.1.2 疾病靶點預(yù)測及藥物-疾病交集靶點的獲取

以“Alzheimer’s disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫、DrugBank Online 數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和TTD數(shù)據(jù)庫中檢索和篩選AD 疾病靶點，共得1 185 個疾病靶點。

借助韋恩圖將“2.1.1”項下核心成分靶點與前述疾病靶點進行映射，取交集后，共得330 個藥物-疾病交集靶點。

2.1.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置高可信度為0.900，去除無關(guān)聯(lián)節(jié)點后，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape3.10.2 軟件對度值大于其中位值的節(jié)點（133 個）進行可視化展示（限于篇幅，該網(wǎng)絡(luò)可掃描本文首頁二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附圖1）。在該PPI網(wǎng)絡(luò)中，有25 個節(jié)點的度值超過20，為核心靶點。其中，部分核心靶點與炎癥通路相關(guān)，如核因子κB亞基1（nuclear factor-kappa B subunit 1，NFKB1）、NF-κB p65、IL-1β、IL-6、TLR4、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）；此外，靶點NLRP3、CASP1 的度值雖低于20，但在炎癥通路中具有重要作用[2]。因此，將上述（核心）靶點作為AD相關(guān)核心炎癥靶點。

2.1.4 “藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.10.2 軟件對藥物、核心成分、交集靶點構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)（限于篇幅，該網(wǎng)絡(luò)可掃描本文首頁二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附圖2）。該網(wǎng)絡(luò)有節(jié)點439 個、邊2 830 條。拓撲學(xué)分析結(jié)果顯示，度值排前12 位的成分依次為panaxacol、去氧哈林通堿（deoxyharringtonine）、龍膽根素（gentisin）、五味子酯乙（gomisin B）、人參炔三醇（panaxytriol）、五味子酯甲（gomisin A）、quinicine、enhydrin、tauremisin、vulgarin、人參環(huán)氧炔醇（panaxydol）、celabenzine，屬核心活性成分。其中，五味子酯乙[10]、人參炔三醇[11]、五味子酯甲[12]、enhydrin[13]、vulgarin[14]、人參環(huán)氧炔醇[15]均具有一定的抗炎活性，為KXS的核心抗炎成分。

2.1.5 基因本體、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫富集分析

將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入Metascape 在線工具進行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。其中，GO 富集包括生物過程（biologicalprocess，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。分別將GO富集結(jié)果（富集基因數(shù)排前10 位）、KEGG富集結(jié)果（富集基因數(shù)排前20 位）導(dǎo)入微生信在線平臺生成氣泡圖。富集結(jié)果（圖1）中，BP 項的“炎癥反應(yīng)”直接指向炎癥，BP項的“磷酸化”與MF項的“磷酸酶結(jié)合”指向磷酸化途徑，KEGG 富集通路項的“NF-κB 信號通路”是重要的炎癥通路[16]。

2.2 分子對接分析

通過PubChem 數(shù)據(jù)庫下載核心抗炎成分五味子酯乙、人參炔三醇、五味子酯甲、enhydrin、vulgarin、人參環(huán)氧炔醇的3D結(jié)構(gòu)，使用Chem 3D軟件進行小分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化；從RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫中下載核心炎癥靶點蛋白NFKB1、NF- κB p65、IL-1β、IL-6、TLR4、TNF、NLRP3、CASP1 的晶體結(jié)構(gòu)，然后使用PyMOL軟件去除水分子和天然配體；使用AutoDock軟件的“AutoGrid”模塊識別活動對接部位，構(gòu)建受體-配體“pdbqt”文件并進行分子對接可視化展示，其結(jié)合能熱圖見圖2（限于篇幅，分子對接示例可掃描本文首頁二維碼鏈接頁面中“增強出版”板塊查看附圖3）。對接結(jié)果顯示，上述成分與靶點之間均具有較強的結(jié)合能力（結(jié)合能＜－0.42 kcal/mol即表示結(jié)合能力較強[17]，1 kcal＝4.184 kJ）。

2.3 動物實驗驗證

基于上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果和相關(guān)文獻[16]，本研究擬從NF-κB信號通路出發(fā)進行驗證。

2.3.1 藥液的配制

分別取遠志、人參、茯苓、石菖蒲飲片90、90、180、90 g，混合，加12 倍量水浸泡0.5 h 后，加熱回流1.5 h，過濾；藥渣加8 倍量水，加熱回流1 h，過濾；合并2 次濾液，減壓濃縮，得質(zhì)量濃度為1 g/mL（以生藥量計）的藥液，于－20 ℃下保存，備用。

2.3.2 分組、造模與給藥

將大鼠隨機分為對照組（CON 組）、模型組（MOD組）、KXS組[1.35 g/（kg·d），以水為溶劑，按成人臨床劑量換算而得]、多奈哌齊組[DON組，1.35 mg/（kg·d），以水為溶劑，按成人臨床劑量的1.5 倍換算而得[18]]，每組8只。除對照組外，其余各組大鼠均腹腔注射250 mg/kg的D-gal（以生理鹽水為溶劑），每天1 次；與此同時，KXS組和DON組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，每天1 次。造模及給藥均持續(xù)12 周。其間，每2 周檢測各組大鼠體重1 次，根據(jù)其體征量化評分、Morris 水迷宮實驗及腦組織切片結(jié)果來判斷AD模型是否復(fù)制成功[19]。

2.3.3 大鼠體征量化評分

實驗期間，由2 位實驗人員對大鼠體征（包括毛發(fā)、皮膚、神情、活動、抓取時抵抗力、扎堆情況）進行量化評分，每4 周評估1 次。具體標(biāo)準參考相關(guān)文獻[20]。采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以x±s 表示，采用單因素方差分析進行多組間比較，采用LSD-t 檢驗（方差齊時）或Games-Howell 檢驗（方差不齊時）進行進一步兩兩比較；不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以M（P25，P75）表示，采用Kruskal-Wallis H檢驗進行多組間比較，采用Wilcoxon 秩和檢驗進行進一步兩兩比較。檢驗水準α＝0.05（統(tǒng)計方法后同）。

結(jié)果（表1）顯示，實驗第8、12 周時，與CON組比較，MOD組大鼠的體征量化評分均顯著升高（P＜0.01）；與MOD組比較，KXS組和DON組大鼠的體征量化評分均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。

2.3.4 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評估

采用Morris 水迷宮實驗于實驗第12 周評估大鼠學(xué)習(xí)記憶能力（其間維持正常給藥），具體操作參考相關(guān)文獻[21]：實驗為期6 d，包括適應(yīng)性訓(xùn)練、定位航行訓(xùn)練及空間探索實驗。首日為適應(yīng)性訓(xùn)練，即每只大鼠游泳1min 以適應(yīng)圓柱形水池（直徑150 cm、深50 cm）環(huán)境并認識逃生平臺（高出水面1.5 cm）。第2 至5 天為定位航行訓(xùn)練，即讓大鼠每天從水池4 個象限入水，記錄其找到平臺（低于水面1.5 cm）的逃避潛伏期（若大鼠60 s 內(nèi)找到平臺，則記錄實際所用時間；若未找到，則記為60 s，并將大鼠引導(dǎo)至平臺停留10 s）。第6 天為空間探索實驗，即移除平臺，將大鼠置于水池固定象限（第3 象限）的特定位置，記錄其60 s 內(nèi)的游泳活動路線，分析其逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、平臺象限路程及時間，作為大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的評估指標(biāo)。

結(jié)果（表2、圖3）顯示，與CON組比較，MOD組大鼠的游泳活動路線復(fù)雜，其逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)、平臺象限路程及時間均顯著減少或縮短（P＜0.05 或P＜0.01）；與MOD組比較，KXS 組和DON組大鼠的游泳活動路線有不同程度簡化，其逃避潛伏期均顯著縮短，KXS組大鼠的穿越平臺次數(shù)、平臺象限路程及時間和DON組大鼠的穿越平臺次數(shù)均顯著增加或延長（P＜0.05 或P＜0.01）。

2.3.5 標(biāo)本采集與臟器指數(shù)檢測

Morris 水迷宮實驗后，稱定各組大鼠體重，將其麻醉后處死，取其大腦。隨機選取每組3 只大鼠的大腦，用4% 多聚甲醇溶液固定，用于后續(xù)HE、尼氏染色觀察；取每組剩余大鼠的大腦，分離海馬組織并凍存，用于后續(xù)Western blot 實驗。同時，收集各組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、胸腺，稱重后計算相應(yīng)臟器指數(shù)并進行組間比較。

結(jié)果（表3）顯示，與CON組比較，MOD組大鼠的心臟、肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。與MOD組比較，KXS組、DON組大鼠上述臟器指數(shù)（KXS組肝臟指數(shù)除外）均顯著升高（P＜0.05）。

2.3.6 大鼠腦組織病理學(xué)變化觀察

取“2.3.5”項下各組大鼠經(jīng)4% 多聚甲醛溶液固定的大腦，進行常規(guī)石蠟包埋、切片后脫蠟水合，分別進行HE染色和尼氏染色，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，以中性樹脂封片，使用顯微鏡觀察其海馬組織CA1、CA3、DG區(qū)的組織病理學(xué)變化，并使用Image J軟件對尼氏染色陽性細胞（邊界清晰，且有完整細胞核）進行計數(shù)。

結(jié)果（圖4、圖5、表4）顯示，CON組大鼠海馬組織的CA1、CA3、DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量豐富、排列緊密，且形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。與CON組比較，MOD組大鼠海馬組織各區(qū)均可見神經(jīng)元皺縮深染、形狀不規(guī)則，細胞核與細胞質(zhì)分界不清晰，尼氏體減少，陽性細胞數(shù)均顯著減少（P＜0.01），甚至出現(xiàn)核仁消失。與MOD 組比較，KXS 組、DON組大鼠海馬組織各區(qū)上述病理改變均有不同程度改善，尼氏體有所增加，陽性細胞數(shù)均顯著增多（P＜0.01）。

2.3.7 大鼠海馬組織中NF-κB信號通路及其上下游蛋白表達檢測

取“2.3.5”項下各組大鼠凍存的海馬組織適量，剪碎后，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑），經(jīng)勻漿、超聲、離心后分離上清液，用BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer，于100 ℃下加熱變性。取變性蛋白適量，進行10%～15% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h；洗膜后，加入TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、NLRP3、CASP1、IL-1β、β-actin 一抗（稀釋比例分別為1∶6 000、1∶6 000、1∶2 000、1∶1 000、1∶6 000、1∶2 000、1∶6 000），4 ℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)的二抗（稀釋比例均為1∶6 000），室溫下孵育1 h；洗膜后，用ECL超敏發(fā)光液顯色，并置于全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)下成像。以β-actin 為內(nèi)參，使用Image J 軟件計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值，以表征目的蛋白的表達水平。結(jié)果以CON 組為標(biāo)準進行歸一化處理（NFKB1 與NF-κB p65 同為NF-κB蛋白家族的成員，IL-6、TNF與IL-1β同為炎癥因子，故未作重復(fù)驗證）。

結(jié)果（圖6、表5）顯示，與CON組比較，MOD組大鼠海馬組織中TLR4、NF- κB p65、p-NF- κB p65、NLRP3、CASP1、IL-1β 蛋白的表達均顯著上調(diào)（P＜0.05 或P＜0.01）。與MOD組比較，KXS組、DON組大鼠海馬組織中上述蛋白（DON組的TLR4、NF-κB p65、IL-1β蛋白除外）的表達均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討論

本研究首先通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得了AD相關(guān)核心炎癥靶點（NFKB1、NF- κB p65、IL-1β、IL-6、TLR4、TNF、NLRP3、CASP1）和KXS用于AD的潛在核心抗炎成分（五味子酯乙、人參炔三醇、五味子酯甲、enhydrin、vulgarin、人參環(huán)氧炔醇）；隨后，通過富集分析獲知，GO功能富集涉及磷酸化、炎癥反應(yīng)等，KEGG富集通路包含NF-κB這一重要炎癥通路；最后，通過分子對接進一步證實了KXS潛在核心抗炎成分與核心炎癥靶點之間具有較高的親和力。由此本課題組推測，KXS可能主要作用于NF-κB信號通路，并通過影響其上下游相關(guān)蛋白的表達來緩解神經(jīng)炎癥，從而發(fā)揮改善AD的作用。

為驗證這一推測，本研究進行了相關(guān)動物實驗。首先，本研究使用D-gal 誘導(dǎo)建立AD大鼠模型，結(jié)果顯示，與CON組比較，MOD組大鼠實驗第8、12 周時的體征量化評分均顯著升高，提示其具有明顯的衰老癥狀（如毛發(fā)干枯發(fā)黃、活動減少、神情呆滯等）；心臟、肝臟、脾臟、胸腺指數(shù)均顯著降低，逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、平臺象限路程及時間等學(xué)習(xí)記憶能力評估指標(biāo)均顯著惡化，海馬組織出現(xiàn)神經(jīng)元皺縮、細胞核與細胞質(zhì)分界不清晰、尼氏體減少等病理改變，表明大鼠上述臟器明顯萎縮、學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退、海馬組織受損嚴重，AD大鼠模型復(fù)制成功。經(jīng)KXS干預(yù)后，AD大鼠的體征量化評分顯著降低，上述臟器指數(shù)（肝臟指數(shù)除外）均顯著升高，各學(xué)習(xí)記憶能力評估指標(biāo)和海馬組織病理改變均有所改善，提示KXS可明顯改善AD大鼠的相關(guān)癥狀，與既往研究基本一致[22]。

NF-κB信號通路是重要的炎癥通路，可介導(dǎo)大腦中的神經(jīng)病變。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是炎癥的中心介質(zhì)，可直接參與調(diào)控多種炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF- α）的表達[23]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB 二聚體（如p65）與NF-κB抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB；如IκBα）結(jié)合，形成NF-κB/IκB復(fù)合物，并停留在細胞質(zhì)中；當(dāng)細胞受到胞內(nèi)外細胞因子、應(yīng)激信號、病原體等刺激時，IκB會被磷酸化，使得NF-κB二聚體被釋放，并引發(fā)進一步的磷酸化（如NF-κB p65 轉(zhuǎn)化成p-NF-κB p65），進而啟動下游炎癥因子的釋放，加劇AD的神經(jīng)炎癥[24]。本研究結(jié)果顯示，MOD組大鼠海馬中NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白的表達均較CON組顯著上調(diào)，提示NF-κB 信號通路被異常激活；經(jīng)KXS干預(yù)后，上述蛋白的表達被顯著逆轉(zhuǎn)，提示KXS可有效抑制NF-κB信號通路所誘導(dǎo)的炎癥過表達。

本研究進一步對NF-κB信號通路上下游相關(guān)蛋白的表達情況進行了分析。其中，TLR4 是該通路常見的上游因子，可激活細胞內(nèi)髓樣分化因子88，進而磷酸化IκB；磷酸化的NF-κB二聚體（如p-NF-κB p65）會進入細胞核，從而啟動促炎因子（如NLRP3 炎癥小體）的轉(zhuǎn)錄，最終形成經(jīng)典的TLR4/NF-κB/NLRP3 炎癥通路[25]。此外，NLRP3 炎癥小體還會繼續(xù)激活CASP1（又被稱作IL-1β轉(zhuǎn)化酶），從而增加炎癥因子IL-1β的分泌[25]。本研究結(jié)果顯示，MOD 組大鼠海馬組織中TLR4、NLRP3、CASP1、IL-1β 蛋白的表達均較CON 組顯著上調(diào)；經(jīng)KXS干預(yù)后，大鼠海馬組織中上述蛋白的表達均顯著下調(diào)，進一步提示KXS緩解AD神經(jīng)炎癥的作用可能與抑制NF-κB信號通路上下游相關(guān)蛋白的表達有關(guān)，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果基本一致。

綜上所述，KXS 能有效改善AD大鼠神經(jīng)炎癥，減輕海馬神經(jīng)元損傷，提高學(xué)習(xí)記憶能力；上述作用可能與抑制NF-κB 信號通路及其上下游相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。