舒肝解郁膠囊對伏立康唑、利伐沙班和阿哌沙班在大鼠體內藥代動力學的影響

舒肝解郁膠囊于2009 年上市，是我國首個獲批用于治療輕中度抑郁障礙的中藥新藥[1]，現主要用于輕中度抑郁障礙、卒中后抑郁、失眠癥伴發輕中度抑郁障礙、其他疾病伴發輕中度老年期抑郁障礙等疾病的臨床治療[2]。該藥為臨床廣泛使用的中成藥之一，由貫葉金絲桃和刺五加兩味中藥組成，其中貫葉金絲桃又名圣·約翰草，是腸道、肝臟代謝酶[如細胞色素P450（cytochromeP450，CYP）酶亞型3A4、2C9、2C19]和轉運體[如P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）]的誘導劑，可影響聯用藥物的藥代動力學特征[3―5]。臨床實踐顯示，舒肝解郁膠囊與其他藥物的聯合使用較為普遍[6―7]，但僅有李曉琳等[8]報道了聯用該膠囊能顯著降低喹硫平的血藥濃度，但能否影響其他聯用藥物的藥代動力學特征尚未可知。

伏立康唑是具有廣譜抗真菌活性的第二代三唑類抗真菌藥物，是侵襲性曲霉菌感染和克柔念珠菌感染的一線治療用藥。伏立康唑在體內主要經CYP2C19 酶代謝，次要經CYP2C9、CYP3A4 酶代謝，加之該藥又是CYP3A4 酶抑制劑，其藥物相互作用是目前臨床關注的重點之一。相關臨床實踐顯示，某患者在服用伏立康唑期間聯合舒肝解郁膠囊等藥物后，其體內伏立康唑的谷濃度長期處于較低水平。本課題組通過綜合分析并查閱相關文獻[9]推測，舒肝解郁膠囊可能影響了伏立康唑的藥代動力學行為，從而導致其谷濃度降低。為進一步探究具體原因，本研究以SD大鼠為對象，擬初步探討舒肝解郁膠囊對伏立康唑藥代動力學行為的影響；同時，結合本課題組前期舒肝解郁膠囊的用藥調研結果和相關藥物的代謝、轉運特征，擬同步探討該藥對利伐沙班（CYP3A4 酶底物和P-gp 底物）、阿哌沙班（CYP3A4 酶底物和P-gp 底物）藥代動力學行為的影響，以期為舒肝解郁膠囊與其他藥物的合理聯用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括LC-30A型超高效液相色譜系統（日本Shimadzu 公司）、AB Sciex 5500 型三重四極桿串聯質譜儀（美國AB Sciex 公司）、AB204-S 型標準型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、ST 16R 型高速離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

舒肝解郁膠囊（每粒裝0.36 g，批號230607）購自四川濟生堂藥業有限公司；伏立康唑對照品（純度＞98%，批號D2112189）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；伏立康唑-d3 對照品（內標，純度≥99.9%，批號D13IB235173）、利伐沙班對照品（純度≥99%，批號H25J9Z64216）均購自上海源葉生物科技有限公司；阿哌沙班對照品（純度≥98%，批號C15069980）購自上海麥克林生物科技有限公司；利伐沙班-d4對照品（內標，純度＞98%，批號21702）購自深圳振強生物技術有限公司；甲酸和乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為純凈水。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體重230～260 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供[生產許可證號SCXK（京）2024-0003]。所有大鼠均飼養于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%、每12 h 晝夜循環的動物房內，自由攝食、飲水。本研究方案獲得河北省人民醫院醫學倫理委員會批準（倫理審查編號2024-DW-094）。

2 方法與結果

2.1 大鼠血漿中伏立康唑、利伐沙班和阿哌沙班質量濃度測定方法的建立

對于大鼠血漿中利伐沙班和阿哌沙班的質量濃度測定，采用本課題組前期已建立并經過方法學驗證的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）法（均以利伐沙班-d4為內標），利伐沙班、阿哌沙班檢測質量濃度的線性范圍分別為5～2 000、1～1 000 ng/mL[10]。本研究僅建立并驗證大鼠血漿中伏立康唑質量濃度測定的UPLC-MS/MS法。

2.1.1 儲備液和相關工作溶液的配制

精密稱取伏立康唑和內標（伏立康唑-d3）對照品適量，用50% 乙腈溶解，制成質量濃度均為1 mg/mL 的儲備液。取上述伏立康唑儲備液，用50% 乙腈稀釋，制成質量濃度分別為400、200、100、80、40、20、8、2 μg/mL 的系列標準曲線工作溶液；同法配制質量濃度分別為300、50、4、2 μg/mL的質控工作溶液，備用。取上述內標儲備液，用乙腈稀釋，制成質量濃度為100 ng/mL的內標工作溶液，備用。

2.1.2 標準血漿樣品和質控血漿樣品的配制

取空白血漿（來自未經任何處理的健康SD大鼠，下同）45 μL，分別加入“2.1.1”項下系列標準曲線工作溶液5 μL，得到質量濃度分別為40、20、10、8、4、2、0.8、0.2μg/mL 的系列標準血漿樣品，備用。取“2.1.1”項下各質控工作溶液，同法配制定量下限質量濃度（0.2 μg/mL）以及低、中、高質量濃度（0.4、5、30 μg/mL）的質控血漿樣品，備用。

2.1.3 血漿樣品處理

取血漿樣品50 μL，加入內標工作溶液450 μL，渦旋混合1 min，以12 000 r/min 離心10 min，取上清液50μL，加入50% 乙腈200 μL，渦旋混勻，備測。

2.1.4 色譜與質譜條件

以菲羅門Titank C18（2.1 mm×100 mm，3 μm）為色譜柱，以水為流動相A、含0.1%甲酸的乙腈為流動相B進行梯度洗脫（0～1.0 min，50%B；1.0～1.5 min，50%B→98%B；1.5～3.0 min，98%B；3.0～3.1 min，98%B→50%B；3.1～4.0 min，50%B）；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；自動進樣器溫度為15 ℃；進樣量為1 μL。

采用電噴霧離子源，以多反應監測模式進行正離子檢測；離子源噴射電壓為5 500 V；離子源溫度為500 ℃；霧化氣、加熱氣、氣簾氣壓力分別為60、50、20 psi；去簇電壓為100 V；用于定量分析的伏立康唑、內標離子對分別為m/z 350.1→281.1 和m/z 353.3→284.2，碰撞能量分別為40、25 V；質譜監測時間為2.8 min。

2.1.5 方法學考察

根據2020 年版《中國藥典》（四部）通則“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的相關要求，對所建大鼠血漿中伏立康唑質量濃度檢測的UPLC-MS/MS法進行方法學考察。

（1）專屬性：取不同來源的大鼠空白血漿、定量下限質量濃度的質控血漿樣品、伏立康唑組某大鼠予伏立康唑1 h 后的血漿樣品，按照“2.1.3”項下方法處理（空白血漿不加內標）后，再按照“2.1.4”項下條件進樣分析，記錄色譜圖。結果（圖1）顯示，伏立康唑及內標的保留時間約為1.4 min，血漿內源性物質不影響伏立康唑的檢測，方法專屬性良好。

（2）標準曲線和定量下限：取“2.1.2”項下各質量濃度的系列標準血漿樣品，按照“2.1.3”項下方法處理后，再按照“2.1.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以伏立康唑質量濃度為橫坐標（x）、伏立康唑與內標的峰面積比值（y）為縱坐標，采用最小加權二乘法（權重因子為1/x 2）進行線性回歸。結果顯示，伏立康唑的回歸方程為y＝0.183x+0.001（r＝0.999 8），檢測質量濃度的線性范圍為0.2～40 μg/mL，定量下限為0.2 μg/mL。

（3）準確度和精密度：按照“2.1.2”項下方法制備定量下限和低、中、高質量濃度的質控血漿樣品，每質量濃度平行6 份，按照“2.1.3”項下方法處理后，再按照“2.1.4”項下條件進樣分析，考察日內精密度（以RSD表示）；連續測定3 d，考察日間精密度（以RSD表示）。準確度以實測質量濃度與理論質量濃度的百分比表示。結果（表1）顯示，伏立康唑日內、日間精密度的RSD 為1.08%～5.51%（n＝6或n＝18），準確度為95.43%～103.67%。

（4）基質效應：取6 份不同來源的空白血漿各50μL，按照“2.1.3”項下方法處理（不加內標），所得上清液即為空白基質；向空白基質加入低、高質量濃度的伏立康唑質控工作溶液和內標工作溶液適量（使伏立康唑最終質量濃度與其低、高質量濃度質控血漿樣品相同），混勻，按照“2.1.4”項下條件進樣測定，記錄峰面積（A）。以50% 乙腈代替空白基質，其余操作同上，制備與前述質量濃度相同的待測溶液，按照“2.1.4”項下條件進樣測定，記錄峰面積（B）。每質量濃度平行6 份，以A 與B 的比值表示伏立康唑和內標的基質效應，再以伏立康唑的基質效應除以內標的基質效應計算內標歸一化的基質效應因子。結果（表2）顯示，伏立康唑的平均基質效應為1.104～1.110，其平均內標歸一化基質效應因子為1.021～1.039，RSD均小于6%（n＝6）。

（5）穩定性：按照“2.1.2”項下方法配制低、高質量濃度的質控血漿樣品，每質量濃度平行6 份，分別考察其在室溫下放置8 h、4 ℃下放置12 h、－80 ℃下放置7 d、反復凍融（－80 ℃至室溫）3 次、處理后在自動進樣器（15 ℃）中放置12 h 的穩定性。結果顯示，在上述條件下，低、高質量濃度質控血漿樣品實測質量濃度的RSD均小于15%（n＝6），準確度為90.25%～110.33%。

（6）殘留效應：取線性范圍上限質量濃度的標準血漿樣品和空白血漿樣品，按照“2.1.3”項下方法處理（處理空白血漿樣品時，以同體積的乙腈代替內標工作溶液）后，再按照“2.1.4”項下條件依次進樣分析，估計伏立康唑的殘留效應（即在伏立康唑對應保留時間處，空白血漿樣品與定量下限質量濃度質控血漿樣品中色譜峰峰面積的比值）。結果顯示，伏立康唑殘留效應符合2020年版《中國藥典》（四部）的相關要求。

2.2 舒肝解郁膠囊對聯用藥物藥代動力學的影響

2.2.1 分組、給藥與樣品采集

SD大鼠經適應性喂養7 d，并禁食、不禁水12 h 后，被隨機分為伏立康唑組（30 mg/kg）、利伐沙班組（2mg/kg）、阿哌沙班組（0.5 mg/kg）、舒肝解郁膠囊+伏立康唑組（145 mg/kg+30 mg/kg）、舒肝解郁膠囊+利伐沙班組（145 mg/kg+2 mg/kg）、舒肝解郁膠囊+阿哌沙班組（145mg/kg+0.5 mg/kg），每組6 只。其中，舒肝解郁膠囊的臨床日劑量為1 440 mg，根據體表面積法[11]換算得大鼠灌胃劑量為145 mg/kg；伏立康唑的日維持劑量為200～400 mg，按照上述方法換算后取中間劑量作為大鼠灌胃劑量，即30 mg/kg；利伐沙班、阿哌沙班的日維持劑量分別為10～20 mg 和5 mg，按照上述方法折算，得大鼠灌胃劑量分別為2、0.5 mg/kg。所有藥物均以0.5% 羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑，混懸后灌胃。

各組大鼠連續灌胃溶劑或舒肝解郁膠囊藥液8 d（每天1 次）后，再于第8 天時分別灌胃伏立康唑、利伐沙班和阿哌沙班藥液，于不同時間點從眼底靜脈叢采集血樣0.2 mL，置于肝素化抗凝管中。結合前期預實驗并參考相關文獻，伏立康唑[12]、利伐沙班[10]單用及相應聯用組的采血時間為給藥前和給藥后0.17、0.34、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12 h，阿哌沙班[10]單用及相應聯用組的采血時間為給藥前和給藥后0.08、0.17、0.25、0.34、0.5、0.75、1、3、5、7、10、12 h。血樣以4 500 r/min 離心10min，分離上層血漿，按照“2.1.3”項下方法處理后，再按照“2.1.4”項下條件進樣分析，記錄峰面積，以隨行標準曲線計算血漿中伏立康唑的質量濃度；按照本課題組前期所建UPLC-MS/MS 法及隨行標準曲線檢測、計算血漿中利伐沙班、阿哌沙班的質量濃度。

2.2.2 數據處理與分析

應用DAS 2.1.1 軟件的非房室模型計算各藥物的主要藥代動力學參數，并采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。數據以x±s 或M（P25，P75）表示，藥時曲線下面積（AUC0－t、AUC0－∞）和峰濃度（cmax）經對數轉換后進行t 檢驗，半衰期（t1/2）、經生物利用度校正的清除率（CLz/F）、經生物利用度校正的表觀分布容積（Vz/F）和達峰時間（tmax）則直接進行t 檢驗（符合正態分布時）或Mann-Whitney U 檢驗（不符合正態分布時）。檢驗水準α＝0.05。

結果（圖2、表3）顯示，與伏立康唑組相比，多次給予舒肝解郁膠囊后，伏立康唑的AUC0－t、AUC0－∞、cmax分別下降了19.4%、22.2%、22.1%，CLz/F 增加了27.3%，tmax亦顯著延長（P＜0.05）；而其余藥代動力學參數組間比較的差異均無統計學意義（P＞0.05）。與利伐沙班、阿哌沙班組相比，多次給予舒肝解郁膠囊聯用后，利伐沙班、阿哌沙班的中位tmax分別由0.75、0.50 h 延長至1.50、1.00h（P＜0.05）；而其余藥代動力學參數組間比較的差異均無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

3.1 分析物檢測方法的建立

本研究結合相關文獻[13―14]及待測藥物性質建立了檢測大鼠血漿中伏立康唑質量濃度的UPLC-MS/MS法。本法中的樣本處理僅采用了簡單的蛋白沉淀法，既操作簡單又可很好地保護色譜柱；氘代內標為UPLCMS/MS 法的常用內標，因此本研究選擇伏立康唑-d3作為內標。為更好地覆蓋藥代動力學參數實測結果范圍，根據預實驗結果，本研究將伏立康唑的標準曲線范圍設定為0.2～40 μg/mL，血漿樣本無需稀釋即可直接檢測，避免了稀釋效應的影響。此外，考慮到伏立康唑治療藥物監測僅針對其原型藥物，故本研究沒有對伏立康唑的氮氧化產物進行定量分析。

3.2 藥代動力學實驗的設計

為充分了解舒肝解郁膠囊對代謝酶、轉運體的影響，并同時確保其能在體內達到穩態，本研究采用了多次灌胃舒肝解郁膠囊的方式。貫葉金絲桃素被認為是貫葉金絲桃中影響代謝酶和轉運體活性的主要成分，在人體內的清除半衰期為8.52～19.64 h[15]。本課題組據此推測，該成分達到穩態的時間約為60～140 h?；诖?，本研究設定舒肝解郁膠囊給藥周期為8 d，以保證藥物可達穩態并避免實驗時間過長。

3.3 舒肝解郁膠囊對伏立康唑藥代動力學參數的影響

研究指出，連續15 d 給予貫葉金絲桃（300 mg，tid）可使伏立康唑（單次口服400 mg）的藥物暴露量降低59%[9]。本研究結果顯示，舒肝解郁膠囊可使伏立康唑的AUC0－t、AUC0－∞、cmax 分別下降19.4%、22.2%、22.1%，與上述文獻結果相似。伏立康唑在體內主要經CYP2C19 酶代謝，次要經CYP3A4、CYP2C9 酶代謝，貫葉金絲桃可影響CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4 酶活性，而刺五加對CYP2C9 酶活性無明顯影響，對CYP3A4 酶活性有一定的抑制作用[16―18]，故本研究初步推測舒肝解郁膠囊可能通過誘導CYP2C19 酶（伏立康唑主要代謝酶）活性而使伏立康唑的暴露量減少。

3.4 舒肝解郁膠囊對利伐沙班和阿哌沙班藥代動力學參數的影響

舒肝解郁膠囊與利伐沙班/阿哌沙班的聯合使用在臨床實踐中并不罕見，但是用藥風險尚未可知。有研究者對舒肝解郁膠囊的臨床使用情況進行分析后發現，該藥用于中老年患者且與其他藥物聯合使用的情況較多，其所含的貫葉金絲桃可能影響聯合用藥的安全性（如減少聯用藥物的體內暴露量）[7]。利伐沙班、阿哌沙班因具有服用方便、相互作用少（與華法林相比）、無需常規監測凝血指標等優勢，現已成為臨床廣泛使用的口服抗凝藥，但不應忽視聯用藥物對其安全性和有效性的影響，如抗腫瘤藥物阿美替尼可使利伐沙班的藥物暴露量增加3 倍以上[10]。

本課題組根據上述文獻推測，聯用舒肝解郁膠囊可能導致利伐沙班和阿哌沙班的藥物暴露量減少，但本研究并未得到此結果。利伐沙班和阿哌沙班分別屬于Ⅱ和Ⅰ類生物制劑，其生物利用度受小腸CYP3A4 酶活性的影響可能大于其受轉運體P-gp 和乳腺癌耐藥蛋白的影響[19―20]。舒肝解郁膠囊雖含有貫葉金絲桃（可誘導小腸CYP3A4 酶和轉運體P-gp），但還含有刺五加，后者對CYP3A4 酶活性具有抑制作用[17―18]，從而可能抵消了貫葉金絲桃對CYP3A4 酶活性的誘導作用，故而舒肝解郁膠囊對利伐沙班、阿哌沙班藥代動力學參數未產生明顯影響；此外，其他代謝酶對利伐沙班和阿哌沙班藥代動力學參數的貢獻有限[19―20]。這可能也是舒肝解郁膠囊對伏立康唑的影響與對利伐沙班/阿哌沙班的影響存在差異的原因之一。

綜上所述，舒肝解郁膠囊可使口服伏立康唑的藥物暴露減少、清除增加、達峰延遲；此外，該藥雖不影響利伐沙班和阿哌沙班的暴露水平，但會導致兩藥達峰延遲。建議臨床在聯合使用舒肝解郁膠囊與伏立康唑時，應注意監測伏立康唑血藥濃度以便及時調整給藥方案，以防伏立康唑血藥濃度偏低而導致治療失??；臨床可同時使用舒肝解郁膠囊與利伐沙班或阿哌沙班。本研究尚未考察舒肝解郁膠囊對靜脈用伏立康唑藥代動力學參數的影響，也沒有探討聯用舒肝解郁膠囊對伏立康唑、利伐沙班、阿哌沙班有效性和安全性的影響，故尚待后續研究予以完善。