載雷公藤甲素靶向制劑的制備及質量、靶向性、細胞毒性評價

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性免疫病，可導致患者多處關節腫脹、受損，甚至造成關節畸形，致殘率較高。據統計，我國RA 的年發病率為0.34%～0.45%，患者人數超過500 萬[1]。RA的發病機制尚不明確，但與多種細胞有關，其中巨噬細胞在病程進展過程中具有關鍵作用[2]。在炎癥關節中，浸潤的單核細胞處于缺氧環境，進而激活巨噬細胞，而這些被激活的巨噬細胞會高表達葉酸受體（folate receptor，FR）、清道夫受體等多種受體[3]。FR與葉酸（folic acid，FA）具有很強的親和力，能介導巨噬細胞大量攝取FA，從而誘發RA[4]。因此，FR可作為靶向治療RA的潛在靶點。

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從藥用植物雷公藤中提取的環氧化二萜內酯化合物，具有抗炎癥、抗類風濕、調節免疫、抑制血管增生及誘導細胞凋亡等作用，對RA具有一定的改善作用[5]。但TP存在水溶性差，肝、腎、生殖毒性較大，生物利用度低等不足，使得其臨床應用嚴重受限[6]。可見，改進現有劑型有望成為實現TP減毒增效的重要策略。靶向聚合物納米粒子能有效改善藥物的溶解度、穩定性、生物利用度，并可延長藥物在體內的循環時間，同時還能通過靶向治療來減少藥物的毒副作用[7]。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolicacid），PLGA]是一種生物相容性良好的可降解高分子聚合物，因其沒有毒性，常被作為藥物載體以制備納米制劑，進而用于癌癥、免疫系統疾病及心腦血管疾病等治療領域[8]。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一種具有良好生物相容性的聚合物，可顯著延長納米粒子的血液循環時間，增加藥物在病灶部位的富集，被廣泛用于生物制藥領域[9]。FA具有分子生物相容性好、穩定性高、易于合成、無免疫原性等優點，現已成為一種極具應用前景的靶向配體[8]。考慮到FA與FR特異性結合這一特點，用FA修飾載藥納米粒子可有助于提高藥物的靶向性、減少藥物的毒副作用[10]。基于此，本研究擬采用乳化揮發法制備載TP靶向FR的聚合物納米粒子（簡稱“TP@PLGA-PEG-FA”），對其形態、粒徑、電位進行表征，對其載藥量及包封率進行測定，對其血液相容性和穩定性進行評價，并通過體外實驗對該制劑的靶向性及對RA 的改善效果進行探討，以期為TP 的深入開發和RA的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Galaxy-170s 型CO2培養箱和5424R 型離心機（德國Eppendorf 公司）、Cary-3500型紫外分光光度計（美國Agilent 公司）、Zetasizer Nano型激光粒度分析儀（英國Malvern 公司）、TS2 型倒置光學顯微鏡和FV3000 型激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）、TM3000 型掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）、168-1130 型酶標儀（美國Bio-Rad 公司）、CP214 型電子天平（美國Ohaus公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

TP 原料藥（批號A10261，純度96.8%）和對照品（批號B20709，純度98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；PLGA-PEG（批號R-PL1025-10K，聚乳酸與羥基乙酸的摩爾比為85∶15）和PLGA-PEG-FA（批號R-PL1045-10K，聚乳酸與羥基乙酸的摩爾比為85∶15）、熒光染料Cy3.5（批號RM0212406）均購自西安瑞禧生物科技有限公司；聚乙烯醇[poly（vinyl alcohol），PVA；批號P434371]、脂多糖（批號L381866）均購自上海阿拉丁生化試劑股份有限公司；RPMI-1640 培養基（批號G4534）和DMEM培養基（批號G4511）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液（批號28718-90-3）購自美國Sigma 公司；CCK-8 細胞增殖及毒性檢測試劑盒（批號CA1210）購自北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物與細胞

健康SD 大鼠，雌性，體重180～220 g，8 周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號為SCXK（京）2021-0011。所有大鼠均飼養在溫度18～26 ℃、相對濕度40%～70%、定期通風換氣的環境中。本動物實驗方案經吉林醫藥學院倫理委員會批準（編號2023-ZYY-005）。

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7 由吉林醫藥學院吉林省抗體工程科技協同創新中心提供。

2 方法

2.1 TP@PLGA-PEG-FA等納米粒子的制備

采用乳化揮發法制備。取TP 原料藥1 mg，溶于甲醇1 mL 中；稱取PLGA-PEG-FA 10 mg，溶于二氯甲烷10 mL中；將上述2 種溶液混勻，乳化1 min，形成油相。將油相加入到3%PVA溶液5 mL中，得油包水乳液；乳化1 min 后，加入2% 異丙醇溶液20 mL，于室溫下振蕩3～5 h，使有機溶劑充分揮發，得TP@PLGA-PEG-FA乳液。上述乳液經15 000 r/min 離心10 min，棄去上清液，沉淀用水重懸并重復洗滌3 次，以去除未包封的TP；再用水重懸后，于4 ℃下保存，備用。

使用同樣方法制備PLGA-PEG空白納米粒子（不加TP，將PLGA-PEG-FA替換為PLGA-PEG）、PLGA-PEGFA空白靶向納米粒子（不加TP）、TP@PLGA-PEG（將PLGA-PEG-FA替換為PLGA-PEG）、Cy3.5@PLGA-PEG（將TP 替換為Cy3.5，PLGA-PEG-FA 替換為PLGAPEG）、Cy3.5@PLGA-PEG-FA（將TP替換為Cy3.5）。

2.2 TP@PLGA-PEG-FA的表征

取“2.1”項下TP@PLGA-PEG-FA、PLGA-PEG-FA空白靶向納米粒子適量，使用掃描電子顯微鏡觀察其形態及分布。取“2.1”項下TP@PLGA-PEG-FA、TP@PLGAPEG適量，使用激光粒度分析儀檢測其粒徑、Zeta 電位及多分散性指數（polydispersity index，PDI），檢測重復3 次。

2.3 TP@PLGA-PEG-FA載藥量和包封率的測定

精密稱取TP對照品，用甲醇稀釋，制成質量濃度分別為30、20、10、5、2.5 μg/mL 的標準溶液。以甲醇為對照，使用紫外分光光度計于217 nm 波長處檢測上述TP標準溶液的吸光度值并記錄其紫外光譜圖。以吸光度值為縱坐標、對應TP 標準溶液的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，并進行方法學考察。

取“2.1”項下TP@PLGA-PEG-FA、PLGA-PEG-FA空白靶向納米粒子各1 mL，分別用水10 mL稀釋，以30μg/mL 的TP 標準溶液為對照，使用紫外分光光度計于217 nm波長處檢測樣品溶液的吸光度值并記錄其紫外光譜圖，再根據前述所得回歸方程計算納米粒子中TP含量，根據下式計算TP@PLGA-PEG-FA的載藥量和包封率：載藥量（%）＝納米粒子中TP 含量/納米粒子的總質量×100%；包封率（%）＝納米粒子中TP含量/TP 總投入量×100%。實驗重復3次。

2.4 TP@PLGA-PEG-FA的體外釋藥實驗

取“2.1”項下TP@PLGA-PEG-FA溶液3 份，各1 mL（其中TP 質量濃度相同），置于透析袋（截留分子量300kDa）中，再分別浸入裝有pH7.4、6.5、5.5 磷酸鹽緩沖液（pH參考文獻[11]設置）50 mL的離心管中，將離心管置于37 ℃搖床中均勻振蕩。分別于0、4、8、10、12、16、24、30、36、42、48、50、60、72 h 時從離心管中取樣5 mL，同時補加等pH等溫等體積的磷酸鹽緩沖液。使用紫外分光光度計于217 nm波長處檢測各時間點取樣溶液的吸光度值，代入“2.3”項下回歸方程計算TP 含量，計算TP 的累積釋放量并繪制釋放曲線。計算公式為：累積釋放×100%（式中，cn為第n 個時間點樣品的質量濃度；V0為溶出介質總體積；ci為第i 個時間點樣品的質量濃度；Vi為取樣體積；m為納米粒子中TP 含量）。實驗重復3 次。

2.5 TP@PLGA-PEG-FA的血液相容性考察

取經抗凝處理的健康大鼠外周血適量，加入生理鹽水，以3 000 r/min 離心10 min 至上清液無色，收集紅細胞并用生理鹽水重懸；將TP 不同質量濃度（400、300、200、100 μg/mL）的TP@PLGA-PEG-FA與等體積的紅細胞懸液混勻，即得供試樣品。另設陽性對照樣品（以水混合紅細胞懸液）和陰性對照樣品（以生理鹽水混合紅細胞懸液）。所有樣品于37 ℃下放置2 h 后，以3 000r/min 離心10 min，取上清液，使用紫外分光光度計于541 nm 波長處檢測其吸光度值，再計算各樣品的溶血率：溶血率（%）＝（待測樣品的吸光度值－陰性對照樣品的吸光度值）/（陽性對照樣品的吸光度值－陰性對照樣品的吸光度值）×100%。

2.6 TP@PLGA-PEG-FA的穩定性考察

取“2.1”項下TP@PLGA-PEG-FA適量，于4 ℃水中放置14 d，每隔2 d 取樣1 次；另將TP@PLGA-PEG-FA置于含10% 胎牛血清的DMEM培養基中，于37 ℃下放置12 h，每隔2 h 取樣1 次。使用激光粒度分析儀檢測其粒徑、PDI、Zeta電位，以評價納米粒子的穩定性。

2.7 RAW264.7細胞對納米粒子的攝取情況考察

TP@PLGA-PEG-FA和TP@PLGA-PEG中沒有發光成分，為考察納米粒子表面耦聯FA是否會提高納米粒子的靶向性，本研究將納米粒子中裝載的TP 替換為熒光染料Cy3.5，用以考察RAW264.7 細胞對納米粒子的攝取情況。取RAW264.7 細胞，以1×105 個/孔接種到24 孔共聚焦培養板中，待完全貼壁后，將其分為激活細胞（以1 μg/mL 的脂多糖刺激24 h）和未激活細胞，分別用含Cy3.5@PLGA-PEG、Cy3.5@PLGA-PEG-FA+游離FA、Cy3.5@PLGA-PEG-FA（Cy3.5 質量濃度均為500 ng/mL）的RPMI-1640 培養基孵育2 h（每組設置3個復孔）；收集細胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次；加入4%多聚甲醛溶液固定30～40 min，再用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次；加入DAPI染液染色5 min，使用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞對納米粒子的攝取情況（細胞核經DAPI 染色后呈藍色熒光，而Cy3.5@PLGA-PEG 和Cy3.5@PLGAPEG-FA呈紅色熒光），并拍照記錄。

2.8 TP@PLGA-PEG-FA的體外細胞毒性考察

取對數生長期的RAW264.7 細胞，以2×104個/孔接種到96 孔板中，待完全貼壁后，將其分為激活細胞（以1μg/mL 的脂多糖刺激24 h）和未激活細胞，用含8% 胎牛血清的RPMI-1640 培養基培養24 h。吸棄培養基，分別加入含不同質量濃度TP@PLGA-PEG-FA、TP@PLGAPEG、游離TP（TP 質量濃度均分別為250、125、62.5、31.25、15.63、7.82 ng/mL，質量濃度根據其半數抑制濃度31.25 ng/mL 設置）的RPMI-1640 培養基，作為實驗組；另設只加細胞、不加藥物的對照組和不加細胞、不加藥物的空白組。每組設置3 個復孔。培養24 h，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，于37 ℃下避光孵育30 min 后，使用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度值，并按下式計算細胞存活率：細胞存活率（%）＝（As－Ab）/（Ac－Ab）×100%（式中，As、Ac、Ab分別為實驗組、對照組、空白組細胞的吸光度值）。

2.9 統計學方法

采用GraphPad Prism 5.0 軟件對數據進行統計分析。所有實驗數據均以-x±s 表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果與討論

3.1 TP@PLGA-PEG-FA的表征

掃描電子顯微鏡結果（圖1）顯示，PLGA-PEG-FA空白靶向納米粒子和TP@PLGA-PEG-FA均呈球形，且分布均勻；兩者的平均粒徑分別為（106.20±0.03）、（122.60±0.02）nm，Zeta 電位分別為（－18.3±0.5）、（－17.6±0.6）mV，PDI 分別為0.28±0.04、0.26±0.02（n＝3）。研究指出，＜200 nm的納米粒子更容易逃避網狀內皮系統的捕獲，并可借助由腫瘤血管滲漏引起的滲透增強及保留效應而在腫瘤部位累積，而RA的病理特性使其病變組織存在與腫瘤部位相似的“ 滲漏”血管系統[12]，故TP@PLGA-PEG-FA 可能借助滲透增強及保留效應在RA關節炎癥組織中累積。此外，由Zeta 電位檢測結果可知，TP@PLGA-PEG-FA荷負電，且此荷電特性不僅可避免納米粒子聚集，而且可以減少與帶負電荷細胞膜間的非特異性相互作用[13]，有利于TP@PLGA-PEG-FA 與細胞膜表面的FR結合，從而發揮主動靶向性。

3.2 TP@PLGA-PEG-FA的載藥量和包封率

紫外光譜圖（圖2A）顯示，TP@PLGA-PEG-FA具有TP 特征吸收峰，說明TP 被成功包載入PLGA-PEG-FA空白靶向納米粒子中。不同質量濃度TP標準溶液的紫外光譜圖（圖2B）顯示，217 nm波長處的吸光度值與TP質量濃度呈正相關。以TP質量濃度為橫坐標（x）、吸光度值為縱坐標（y），經最小二乘法擬合得到的回歸方程為y＝0.120 6x+1.006 1（R 2＝0.993 7），TP 檢測質量濃度的線性范圍為2.5～30 μg/mL；該方法的精密度、穩定性、重復性、回收率試驗結果均符合2020 年版《中國藥典》（四部）的相關要求[14]。根據“2.3”項下公式計算得TP@PLGA-PEG-FA 中TP 的載藥量和包封率分別為（7.78±0.05）%和（68.62±0.03）%（n＝3）。

3.3 TP@PLGA-PEG-FA的累積釋放量

體外釋藥實驗結果（圖3）顯示，TP@PLGA-PEG-FA的釋藥行為具有明顯的pH 依賴性，且隨著pH 值的下降，藥物釋放速率明顯加快。其中，TP@PLGA-PEG-FA在pH5.5 的磷酸鹽緩沖液中72 h 時的累積釋放量為（84.83±0.29）%，較pH7.4、6.5 磷酸鹽緩沖液中72 h 時的累積釋放量[分別為（42.37±0.35）%、（63.83±0.29）%]顯著升高（P＜0.05）。分析原因可能是，PLGA的降解可影響聚合物納米粒子的釋藥性能，在水環境中，聚合鏈的纏繞程度將隨著納米粒子的膨脹而發生變化，使水溶性降解產物濃度增加，而TP@PLGA-PEG-FA中含有親水基團PEG，導致其親水性更強、釋藥更快；此外，酸性條件可影響聚合物納米粒子中酸性低聚物的均勻度，從而加速PLGA的降解[15]。

3.4 TP@PLGA-PEG-FA的溶血率

血液相容性考察結果（圖4）顯示，與陰性對照樣品相比，即便是400 μg/mL 的TP@PLGA-PEG-FA 也未引起溶血現象，而且上清液澄清透明。100、200、300、400μg/mL 的TP@PLGA-PEG-FA 的溶血率分別為0.77%、0.92%、1.34%、1.63%，均低于3%，表明TP@PLGA-PEGFA具有良好的血液相容性[16]，可用于體內注射。

3.5 TP@PLGA-PEG-FA的穩定性

穩定性考察結果（圖5）顯示，TP@PLGA-PEG-FA在4 ℃水中放置14 d 和在37 ℃、含有10% 胎牛血清的DMEM培養基中放置12 h 的粒徑、PDI、Zeta 電位均無明顯變化，表明TP@PLGA-PEG-FA 具有良好的穩定性。這可能歸因于該納米粒子表面的負電荷和PEG對納米粒子表面的空間保護作用[17]。

3.6 細胞對TP@PLGA-PEG-FA的攝取情況

結果（圖6）顯示，在激活的RAW264.7 細胞中，經Cy3.5@PLGA-PEG-FA 處理的細胞核周圍出現明顯的紅色熒光，而經游離FA 預處理后再經Cy3.5@PLGAPEG-FA處理的細胞核周圍紅色熒光明顯減弱，且后者與Cy3.5@PLGA-PEG處理細胞比較未見明顯差異。在未激活的RAW264.7 細胞中，經Cy3.5@PLGA-PEG、Cy3.5@PLGA-PEG-FA+ 游離FA、Cy3.5@PLGA-PEGFA處理的細胞核周圍均有較弱的紅色熒光，但三者無明顯差異。上述結果顯示，激活的巨噬細胞能更有效地攝取Cy3.5@PLGA-PEG-FA；若提前使用FA預處理，FA則可先與激活的RAW264.7 細胞表面的FR結合，從而導致Cy3.5@PLGA-PEG-FA 的靶向作用減弱，表明FA 修飾可明顯提高納米粒子的主動靶向性。

3.7 TP@PLGA-PEG-FA的體外細胞毒性

針對未激活RAW264.7 細胞的體外毒性實驗結果（ 圖7A）顯示，當TP 質量濃度≥62.5 ng/mL 時，TP@PLGA-PEG-FA 組、TP@PLGA-PEG 組未激活細胞的平均存活率均小于50%；而當TP 質量濃度≥15.63ng/mL，游離TP組未激活細胞的平均存活率均小于50%；當TP質量濃度≥15.63 ng/mL 時，游離TP組的細胞存活率均顯著低于同質量濃度TP@PLGA-PEG-FA 組和TP@PLGA-PEG組（P＜0.05）。這主要歸因于游離TP可通過擴散作用直接作用于細胞；而TP@PLGA-PEG-FA、TP@PLGA-PEG則是通過細胞內吞作用將藥物送入未激活的巨噬細胞中，從而導致細胞對納米粒子的攝入量不足、藥物毒性減弱。

針對激活RAW264.7 細胞的體外毒性實驗結果（圖7B）顯示，當TP 質量濃度≥15.63 ng/mL 時，TP@PLGAPEG-FA組激活細胞的存活率均顯著低于同質量濃度游離TP 組（P＜0.05）。這主要是因為TP@PLGA-PEG-FA表面存在FA，增加了激活巨噬細胞對納米粒子的攝入量，從而使TP得以積累、藥物毒性得以提高。

4 結語

本研究制備了一種FA 表面修飾的靶向納米粒子TP@PLGA-PEG-FA，該制劑血液相容性好，可有效改善TP的水溶性和穩定性，在炎癥組織的微酸性環境中能快速釋放TP，提高藥物利用率。體外細胞實驗表明，TP@PLGA-PEG-FA對炎癥細胞具有主動靶向性，能通過FA-FR 結合而被激活的RAW264.7 細胞高效攝取，從而發揮細胞毒性作用。