玫瑰和桂花復配提取物的體外護膚功效研究

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007－8517（2025）11－0030-05

DOI： 10.3969/j .issn.1007-8517.2025.11.zgmzmjyyzz202511007

Study on in Vitro Skincare Effect of Rose and Osmanthus Flower Compound Extract

CHEN Zhixiong1XIA Jin2ZHU Tingheng2YAN Cui1HONG Ni1CAO Ping1 1.Huzhou Jahen Industrial Co.，Ltd.，Huzhou 31300o，China; 2.Wukang Sub-district Community Health Service Center of Deqing County，Deqing 3132Oo，China; 3.College of Biotechnologyand Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310ooo，China

Abstract：ObjectiveTo investigatetheskincare efectsof Damascusroseandosmanthus flowercompound extract（ROT）on whitening，anti-oxidation，andanti-agingin vitro，various methodswereemployed.MethodsTheimpactofROTonthegrowth activityof B16F10cellswasasessedusing theCCK-8method，while the DPPHscavengingabilityandABTSscavengingabilityof ROTwas evaluated throughafreeradicalscavenging test.Theefectof ROTonmelanincontentinB16F10cels wasdetermiedusing thesodiumhydroxidecrackingmetod，andtheinhibitionofelastasebyROTwasstudiedthroughanelastaseinhibitiontestAddion aly，the eyeiitationpotentialofROTwasexaminedusingthechickembroalantoic membranemethod.ResultsTeresultsindicated that ROT concentrations ranging from 0. 1% to 2% had no adverse effects on B16F1O cell growth. Furthermore，the DPPH and ABTS test demonstrated that ROT concentrations of 0.5% to 2% exhibiteda high free radical scavenging ability of up to 90% .The melanin content influence test revealed that ROT concentrations of 0.1% to 2% significantly inhibited melanin production in B16F10 cells.Moreover，the elastase inhibition experiment showed that ROT concentrations of 0.1% to 2% effectively inhibited elastaseactivitynaconcentration-dependent manner.ThechickembryoalantoicmembranemethodconfirmedthatROTdidnotcauseeyeritation.ConclusionROTdemonstrated notableabilitiesinclearingDPPHandABTS，inhibitingmelaninproductioninB16F1cells， andinhibitingelastaseactivityinvitro，allwilesowingnoeyeiitationTesefidingssuggestthatROT，asaskinareactiesubstance，holds promise for in vitro whitening，antioxidant，and anti-aging effcts，with a certain levelof safety.

Key words：ROT；in Vitro Efficacy；Cell；Security

玫瑰，薔薇科薔薇屬灌木，是一種藥食同源植物[1]。玫瑰在我國新疆、甘肅、平陰等地大量種植，國內的玫瑰品種主要包括山東平陰傳統玫瑰、河南鄢陵玫瑰、北京妙峰山玫瑰等2，國外引進的玫瑰主要包括大馬士革玫瑰花、保加利亞玫瑰花等。玫瑰花中富含黃酮、多酚、多糖和氨基酸等活性成分，具有顯著的護膚功效[3]。周穎等[4]發現通過水蒸氣蒸餾法獲得的玫瑰純露含有維生素E、胡蘿卜素等活性成分，且具有補水保濕、滋養護發等功效。曹陽5研究發現玫瑰提取物在體外能顯著抑制酪氨酸酶活性和抑制黑色素的生成。

桂花，作為木犀科木樨屬植物，又稱九里香、金桂、銀桂等，是我國的傳統十大名花之一。桂花含有糖類、黃酮、蛋白質等多種活性物質，具有抗炎、抗氧化、抑菌等功效[7]。王玥等[8]研究表明桂花發酵液具有顯著的DPPH、ABTS自由基清除能力。包騏林等研究發現桂花提取物在體內外都具有較好的抗氧化活性。譚志梅等[\"提取了桂花色素，并研究發現桂花色素對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等具有顯著的抑菌功效。

本實驗利用體外B16F10黑色素細胞模型研究ROT的體外美白護膚功效，利用DPPH和ABTS清除其抗氧化功效，通過彈性蛋白酶抑制其體外抗衰功效，并通過雞胚尿囊膜方法研究其眼刺激性，為化妝品活性物體外功效研究提供方法參考。

1材料與方法

1.1主要實驗材料小鼠黑色素瘤細胞（B16F10細胞）（上海富恒生物科技有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、CCK－8試劑盒、TargetMol、DMEM培養基、二甲基亞礬（細胞培養級別）（北京索萊寶生物科技有限公司）；胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；N-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸－對硝基苯胺（N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide，AAAPAN）、沒食子酸標準品（EGCG）（美國sigma公司）；維生素C（Vc）、彈性蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH檢測試劑盒、ABTS檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAisoPluskit、Prime-ScriptTMRT reagentKit、TBGreenqPCR（寶日醫生物技術有限公司）；SPF雞蛋（江蘇勃林格殷格維通生物技術有限公司）；大馬士革玫瑰和桂花復配提取物：ROT（湖州嘉亨實業有限公司自制）。

1.2主要實驗設備二氧化碳培養箱、HWS-12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；倒置熒光顯微鏡（上海啟步生物科技有限公司）；TDL-60C低速離心機（上海安亭科學儀器廠）；多功能酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Bio-radCFXConnect（伯樂生命醫學產品有限公司）；正大微生物全自動孵化機（山東省德州市正大孵化設備基地）。

1.3 實驗方法

1.3.1細胞培養用DMEM培養基（含胎牛血清10% 和青鏈霉素 1% ）培養B16F10細胞，在37^°C 、 5% 的 CO₂ 培養箱里面培養細胞達到濃度85% 左右，使用胰蛋白酶消化 3～5min ，觀察細胞狀態為圓形且不貼壁后加入DMEM培養液使其消化結束，再離心收集細胞，最后使用DMEM培養基緩慢吹打細胞懸液并進行計數鋪板，用于下面的細胞相關實驗。

1.3.2B16F10細胞的活力檢測選用CCK-8法測B16F10細胞的活性，選取對數生長中的B16F10細胞，根據 5×10⁴ 個細胞/孔接種到96孔細胞培養板中，放人二氧化碳培養箱中培養過夜。實驗分為空白組、實驗組（添加ROT體積分數分別為0.1% 、 0.2% 、 0.5% 、 1% 、 2% ），每組設置5個復孔，樣品作用于細胞 24h 后再加入CCK-8試劑， 3～4h 后在酶標儀 450nm 處測吸光度。按照以下公式計算相對細胞活性：

相對細胞活性

1.3.3 DPPH自由基清除能力檢測 DPPH自由基清除能力實驗嚴格按照試劑盒說明書進行測定，以維生素C（Vc）作陽性對照，Vc和ROT測試濃度均為 0.1% 、 0.2% 、 0.5% 、 1% 和 2% ，每組濃度3次重復。按照以下公式計算清除率：

1.3.4ABTS自由基清除能力檢測ABTS自由基清除能力實驗嚴格按照試劑盒說明書進行測定，以維生素C（Vc）作陽性對照，Vc和ROT測試濃度均為 0.1% 、 0.2% 、 0.5% 、 1% 和 2% ，每組濃度3次重復。按照以下公式計算清除率：

ABTS 自由基清除率（%）=（1-實驗組A7m）1.3.5B16F10細胞的黑色素含量檢測 參考蔣勇炫等[1]的實驗方法培養B16F10細胞，選擇對數生長中的B16F10細胞進行實驗，用 0.25% 的胰蛋白酶消化細胞，按照每孔 5×10⁵ 個細胞接種在6孔板中，置于二氧化碳培養箱培養過夜，注意B16F10細胞的生長狀況，若細胞狀態良好棄去上清液，加入DMEM培養基后再加入 200μL 的樣品進行檢測，樣品濃度分別為 0.1% 、 0.2% 70.5% 、 1% 、 2% ，每組ROT濃度設置5個復孔。培養 ^48h 后，每孔棄去上清液，PBS清洗1～2次，加入 200μL 含有 10% DMSO的氫氧化鈉溶液，在 80^°C 水浴鍋中反應 40min ，最后在多功能酶標儀上 405nm 處測吸光度。計算公式為：

相對黑色素含量

1.3.6彈性蛋白酶活性檢測參考王麗麗等[1]的實驗方法進行彈性蛋白酶抑制實驗，并在此基礎上稍加修改。取 85μL50mmol/LTris-HCl 緩沖液 （ pH8.0 ）與 15μL 的ROT混合后加人 25μL 彈性蛋白酶溶液（ ），在 25^qC 下孵育15min ，然后再加入 25μL1.015mmol/L AAAPAN溶液，大約 15min 后在 410nm 處測定吸光度值，彈性蛋白酶溶液和AAAPAN溶液均用 50mmol/L Tris-HCl緩沖液（ pH8.0 ）配制，以EGCG溶液作為陽性對照，每個濃度組測定3次。彈性蛋白酶的抑制率計算公式為：

式中：A指樣品ROT和酶的反應溶液的吸光度；B指無酶的反應溶液的吸光度；C指無ROT的反應溶液的吸光度；D指無ROT和酶的反應溶液的吸光度。

1.3.7雞胚絨毛尿囊膜實驗采用雞胚絨毛尿囊膜實驗方法代替傳統的動物實驗方法來評價樣品的眼刺激情況[13]，雞胚絨毛尿囊膜實驗方法參照《化妝品評價替代方法標準實施指南》第八章第二節，選用反應時間法進行試驗，同時設置陰性（ 0.9% NaCl）和陽性對照組（ 0.1mol/LNaOH） 。1.4數據分析實驗結果采用Excel處理數據并用Origin軟件進行統計學分析，實驗組均重復3次，數據以均值加減標準差（ ）表示，各組間使用單因素方差分析， Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1ROT對B16F10 細胞生長活性的影響含有體積分數為 0.1%～2% 的ROT作用于B16F10細胞 24h 后，再采用CCK-8試劑檢測其生長活性。實驗結果如圖1所示，體積分數為 0.1%～2% 的ROT對B16F10細胞的生長活性均沒有影響，可知在這濃度范圍內的ROT對B16F10細胞沒有毒性，可用于后續的其他細胞相關功效檢測實驗。

2.2ROT對DPPH自由基清除能力的影響清除自由基也被叫作抗氧化，人體中自由基過量時，會產生衰老等相關癥狀。早在1958年就已經出現DPPH法用于檢測食品等樣品的抗氧化能力[4]本實驗選取體積分數為 0.1%～2% 的ROT檢測清除自由基的能力，如圖2所示， 0.1% 、 0.2% 、0.5% ROT清除DPPH自由基能力逐漸遞增，具有濃度依賴性，在 0.5% 時清除DPPH自由基能力達到 90% ，與陽性對照組 0.5%Vc 相比，清除DPPH自由基能力一致。在 0.5% ROT濃度后，清除DP-PH自由基的能力稍微有點下降，比陽性對照組Vc清除DPPH自由基能力低。本實驗證明了ROT具有較高的清除DPPH自由基能力，推測ROT具有一定的體外抗氧化護膚功效的潛力。

2.3ROT對ABTS自由基清除能力的影響ABTS清除能力檢測作為評估抗氧化劑效果的常用方法之一，通過檢測樣品對ABTS自由基的清除能力，可評估其抗氧化效果，該方法廣泛應用于食品和化妝品等領域[15]。如圖3所示，ROT 隨著體積濃度的增加，清除ABTS自由基能力逐漸遞增，具有一定濃度依賴性。在 2% 時清除ABTS自由基能力達到 90% 以上，與陽性對照組 2% Vc相比，均具有有效的ABTS自由基清除能力。本實驗證明了ROT具有較高的清除ABTS自由基能力，與2.2DPPH結果相一致，推測ROT具有一定的體外抗氧化護膚功效的潛力。

2.4ROT對B16F10 細胞的黑色素含量的表達如圖4所示，實驗結果顯示體積分數為 0.1%～2% 的ROT均能顯著抑制B16F10細胞中黑色素的生成，且與空白對照組相比具有顯著的統計學差異。B16F10細胞是體外篩選化妝品美白劑的常用細胞模型，具有成本低、周期短的特點。結合上述細胞生長活性實驗結果推斷，體積分數為 0.1%～2% 的ROT具有體外抑制黑色素生成的美白護膚功效的潛力。

2.5ROT對彈性蛋白酶的抑制能力彈性蛋白酶能夠水解膠原蛋白、彈性蛋白等多種蛋白質，而皮膚中的彈性蛋白被水解后，將會導致皮膚衰老等癥狀，因此彈性蛋白酶是常用的抑制皮膚衰老的研究靶點[16]。如圖5所示，體積分數為 0.1% ＼～2% 的ROT對彈性蛋白酶的抑制率逐漸升高，具有濃度依賴性，且在 2% 時對彈性蛋白酶的抑制率最高，達到 26% ，但是和EGCG對照組相比抑制效果較低。實驗結果證明，一定濃度的ROT對彈性蛋白酶活性具有一定的抑制效果，推測一定濃度的ROT具有體外抗衰老的護膚功效潛力。

圖4ROT對B16F10細胞中黑色素生成的影響情況圖

注：與空白對照組相比， ^***Plt;0.001 。

2.6眼刺激性實驗本實驗嚴格按照《化妝品評價替代方法標準實施指南》第八章第二節雞胚絨毛尿囊膜實驗方法，使用 0.1mol/LNaOH 作為陽性對照并用生理鹽水作為陰性對照。通過雞胚絨毛尿囊膜實驗發現，ROT原液沒有眼刺激性，推測ROT作為化妝品活性物具有一定的安全性。

3結論

體積分數為 0.1%～2% 的ROT作用于B16F10細胞 24h 后，CCK-8實驗結果表明均對細胞的生長活性沒有影響，因此選擇 0.1%～2% 的濃度用于后續的功效。通過自由基清除能力實驗表明， 0.1%～2% 濃度ROT均有清除DPPH和ABTS自由基能力，且在 0.5% 時清除DPPH自由基能力達到 90% ，而在 2% 時清除ABTS自由基能力達到 90% 。與陽性對照組Vc相比，ROT均具有一定清除DPPH和ABTS自由基能力。從彈性蛋白酶活性實驗結果表明， 0.1%～2% 濃度的ROT對彈性蛋白酶活性都具有一定的抑制效果，且抑制效果具有濃度依賴性，但與陽性對照EGCG相比，抑制效果比較弱；最后通過雞胚絨毛尿囊膜實驗表明，ROT沒有眼刺激性。綜上所述，推測ROT作為一種護膚活性物具有體外美白、抗氧化、抗衰老護膚功效的潛力，且具有一定的安全性。

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[16］姚紅柳．幾種天然彈性蛋白酶抑制劑抑制作用的研究［D]．長春：長春師范大學，2023.（收稿日期：2024-08-30編輯：陶希睿）

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