肝細胞癌腫瘤微環境相關基因與預后的關系

肝癌是高發病率、高致死率的惡性腫瘤，占全世界癌癥發生率的 6%^[1] ，肝細胞癌（hepato-cellularcarcinoma，HCC）是全世界最高發的肝癌類型，約占原發性肝癌總數的 75%～90%^[2] 是肝癌研究的重點[3]。HCC 的發生發展主要由復雜的因素協同作用共同促進肝炎-肝硬化-肝癌的轉變效應，其中腫瘤微環境（tumormicroenvironment，TME）是近幾年研究癌癥發生及耐藥機制比較熱門的因素之一[4]。TME 是腫瘤細胞所處的細胞環境，其在腫瘤的生長和進展中起著關鍵作用主要組成包括細胞外基質、可溶性分子和腫瘤基質細胞還有眾多免疫細胞[5]，免疫細胞和基質細胞是其兩種主要類型的非腫瘤組分，并且已被提出對于腫瘤的診斷和預后評估是有價值的[6-7]。在這篇文章中，使用基因表達數據庫（geneexpressionomnibus，GEO）分析在癌旁組織與HCC組織中腫瘤微環境中的基質細胞與免疫細胞的表達差異，探討其與HCC患者臨床表征和預后的相關性，為研究肝細胞癌的靶向藥物聯合治療提供新思路和理論基礎。

1材料與方法

1.1數據下載及注釋

從GEO數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds）下載公共原始數據，包括探針矩陣文件（GSE76427_ series_ matrix.txt.gz）和平臺文件（GPL10558_HumanHT_12_V4_0_R1_15002873_B.txt），其中樣本總數167個（癌旁組織樣本52個，HCC組織樣本115個）。將平臺文件探針矩陣轉化成基因矩陣，根據ESTIMATE算法繼而得到腫瘤微環境的打分結果[8]，將免疫細胞和基質細胞分為高評分組和低評分組，并取上調和下調基因的交集，對基因集進行基因功能注釋。本研究使用的所有數據均從GEO下載，數據的收集和使用均按照GEO的出版指南和數據訪問政策進行，無需獲得當地倫理委員會的額外批準。

1.2基因富集分析

通過R包clusterprofiler對DEGs進行功能富集分析以識別GO（geneontology，GO）類別。利用聚類分析器參照京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）路徑進行路徑富集分析，以 FDRlt;0.05 作為分界點。

1.3蛋白-蛋白相互作用

在 STRING 10.5 平臺（https：//string-db.org）構建蛋白-蛋白相互作用（protein-proteininteraction，PPI）網絡模型，將蛋白種類設置為“Homosapiens”，將最低相互作用閾值設置為“highest confidence”（ gt;0.96） ，其他參數保持默認設置，以獲得PPI網絡效果。

1.4DEGs體外實驗驗證

培養L-02正常肝細胞和HePG2肝癌細胞，對數生長期的HePG2細胞分別用阿霉素（Adria-mycin，ADR）不同濃度（7.5、15.0、 30.0mg/ L）處理 24h ，觀察細胞生長情況，計算IC50值，并用于后續RNA收集。以總RNA約 1μg 為模板進行反轉錄生成cDNA。在ABIQuantStudioDx系統上使用TrantStartGreenqPCRSuPerMix（北京，中國）評估靶基因表達水平，以GAPDH表達水平作為內參，然后，采用 2^-ΔΔCT 方法計算目標基因的相對表達量。PCR所用引物由生工生物技術公司合成（見表1）。

1.5統計學分析

采用Perl軟件對數據文本進行預處理。SPSS（IBMCorP.Armonk，NY，USA），R語言（R-Project.org），Bioconductor項目提供的軟件包（www.bioconductor.ORG）進行統計分析和制圖。使用R軟件包“survival”進行生存分析，然后使用“survminer”軟件包繪制生存曲線。采用Wilc-oxon秩和檢驗法測定HCC樣本組織及鄰近組織中的DEGs。采用R軟件分析免疫細胞和基質細胞之間的DEGs。根據得分，將模型擬合到“limma”包框架中，并使用配對 χ_t 檢驗對感興趣的假設進行檢驗[10]。 p 值已針對多重假設檢驗進行校正，并以FDR值表示（ plt;0.05） ， p 值由雙側檢驗得出。

2結果

2.1評分和生存及臨床性狀的關系

從GEO數據庫下載了115名HCC患者的基因表達圖譜和臨床信息。基于ESTIMATE算法，免疫評分分布在 -808.82～2623.22 之間，基質評分范圍分別為-1556.65＼～1076.46，綜合評分分布在-2365.48～3014.57 之間。HCC腫瘤微環境中的免疫細胞與基質細胞評分和臨床性狀（性別、T分期等）沒有相關性（圖1）。總生存期（overallsurvival，OS）與免疫評分具有潛在相關性，Ka-PlaneMeier生存曲線（圖2B）顯示免疫評分低評分組的中位OS的病例數低于高評分組（對數秩檢驗 p=0.013 。

A免疫評分與BCLC分期的關系；B免疫評分與性別的關系；C免疫評分與T分期的關系；D基質評分與BCLC分期的關系；E基質評分與性別的關系；F基質評分與T分期的關系

A綜合評分與生存差異的關系圖；B免疫評分與生存差異的關系圖；C基質評分與生存差異的關系圖

2.2基質細胞與免疫細胞基因差異表達

為了揭示整體基因表達譜與免疫評分和/或基質評分的相關性，比較GEO數據庫中167例HCC患者的Illumina微陣列數據。圖3A、B中的熱圖顯示了免疫評分高與基質評分低組病例的不同基因表達譜，此外，Venn圖（圖3C，D）顯示，460個基因在高分組中普遍上調，34個基因普遍下調。為了概述DEGs（differentially expressedgenes，DEGs）的潛在功能，對高免疫評分組的460個上調基因和34個下調基因進行了功能富集分析。

A基質細胞表達熱圖；B免疫細胞表達熱圖；C基質細胞與免疫細胞上調表達基因交集圖；D基質細胞與免疫細胞下調表達基因交集圖

2.3基因功能聚類分析（genefunctionclusteranaly-sis）

在Venn圖中發現在高分組中有460個基因普遍上調，34個基因普遍下調。為了揭示差異表達基因的潛在功能，對免疫和基質評分普遍上調和下調的基因進行功能富集分析。通過RPackageclusterProfiler對494個差異表達基因進行基因的功能注釋及通路富集分析，根據 FDRlt;0.05 進行篩選，結果表明494個靶點參與了702個生物過程相關的條目、65個細胞組成相關條目、70個分子功能相關條目。ToPGO術語確定了中性粒細胞激活、細胞因子參與并介導免疫反應（圖4A）。將通路富集分析結果 plt;0.05 的前30條通路進行可視化（圖4B）。圖4中長方形條框越長，表明通路富集到的基因數目就越多；顏色越紅，表明p值越小。

A基因功能注釋分析；B基因富集通路分析

2.4蛋白互作網絡分析

共同靶點構建蛋白-蛋白相互作用網絡模型（圖5A）。其中CXCL8、CXCL10、JUN、OAS2、MX1、MX2、SYK等基因為中樞核質相互作用基因，是富集相互作用數目最多的基因，直接作用基因數最高為10個，combined_ score最高可達0.999。根據相互作用的蛋白數 ?5 個，可以將各基因蛋白進行可視化直觀展示（圖5B）。

A基因相互作用網絡關系圖；B基因相互作用的富集數目

2.5預后基因生存相關性

在免疫高評分組中，544個基因根據（ plt; 0.05）進行篩選，得到87個與HCC生存分析具有顯著意義的基因見表2。進一步過濾，篩選得到8個基因表達與HCC生存分析比較，差異有統計學意義（ plt;0.01 ），分別是ALOX5AP、BST2、BTK、CD48、CECR1、CORO1A、DOCK2、Clorf162，各基因表達與生存關系分析圖如圖6所示，在87個具有顯著生存意義的基因中選取蛋白互作基因數目5個及以上的基因可以得到8個二級核心基因，分別是ALOX5AP、BST2、BTK、CCL5、COL6A1、HLA-DMB、HLA-DRA、RAC2。其中BST2、BTK均是與HCC生存預后分析比較，差異有統計學意義性（ plt;0.01 ）且蛋白互作數目多的一級核心基因。

AALOX5AP基因表達與生存關系差異；BBST2基因表達與生存關系差異；CBTK基因表達與生存關系差異；DCD48基因表達與生存關系差異；ECECR1基因表達與生存關系差異；FCORO1A基因表達與生存關系差異；GDOCK2基因表達與生存關系存在差異；HC1orf162基因表達與生存關系也存在差異。

2.6DEGs的體外驗證

ADR作用于HePG2細胞24h的IC50為82.5mg/L 。如圖7所示，所有8種DEGs在經ADR處理的HePG2細胞中表達與對照組相比均有顯著差異。然而，只有BST2和BTK基因在肝癌和正常肝細胞系中表達有顯著差異并具有量-效關系（ plt;0.05） 。BST2和BTK是在HCC腫瘤微環境中起重要作用的 DEGs 。

以L-02細胞為對照組，以* plt;0.05 ，** plt;0.01 ，****plt;0.001 為差異有統計學意義。（A）不同濃度ADR對HePG2細胞存活率的影響；（B）ALOX5AP；（C）BST2；（D）BTK；（E）CD48；（F）CECR1；（G）CO-RO1A；（H）DOCK2；（I）C1orf162

3討論

GEO數據庫的數據挖掘已被廣泛用于預測癌癥預后及預后基因差異分析，在這項工作中，筆者分析了這87個DEGs的總體生存分析結果，挖掘了8個（ALOX5AP、BST2、BTK、CD48、CECR1、CORO1A、DOCK2、C1orf162）與 HCC預后生存顯著性差異最強的基因（ plt;0.01 ），其中BST2、BTK這兩個基因是蛋白互作基因數目的一級核心基因。此后進行體外細胞實驗也驗證了前面的分析篩選，這證明了基于GEO數據庫使用ESTIMATE算法對HCC腫瘤微環境相關基因進行大數據分析的預后價值。

BST2，也被稱為CD317，是一種跨膜糖蛋白。BST2在HCC組織中高表達，被認為是縮短肝癌患者OS 的重要臨床預后指標[]。它參與B細胞的生長發育，并能有效激活核因子 -σ_KB （NF-π_KB ），從而在免疫中發揮重要作用。BST2表達升高與腫瘤大小和數量的增加密切相關，但BST2與miR-760 聯合可促進腫瘤細胞凋亡[12]。BST2 也是膠質瘤預后不良的獨立危險因素[13]。BST2 高表達HCC患者的總生存率較低。它被認為是HCC的獨立不良預后因素，與肝癌的發生發展密切相關，并有助于腫瘤轉移[14]。另一個核心基因布魯頓酪氨酸激酶（BTK）是一種細胞質酪氨酸激酶，是與人類癌癥發病相關的Tec激酶家族中唯一的成員[15]。該基因編碼的蛋白質在B細胞發育中起著至關重要的作用，該基因突變會產生免疫缺陷，導致不能產生成熟的B淋巴細胞進而誘發惡性腫瘤HCC[16-17]

中性粒細胞是宿主防御的關鍵防線，在消除感染中發揮著重要作用[18-19]。然而，中性粒細胞黏附增加導致中性粒細胞與內皮細胞之間的相互作用增強，從而導致血管內皮損傷和器官功能障礙[20-21]，并且過度嗜中性粒細胞激活可能會對宿主有害，導致附屬組織損傷[22]，包括分泌促炎介質導致炎癥進而誘導癌癥 HCC^[23] 。細胞因子在炎癥過程的協調以及與炎癥相關的癌癥中發揮著廣泛免疫調節作用[24]，對人類生物學和疾病至關重要。細胞外基質對炎癥及腫瘤免疫反應是密不可分的，研究細胞外基質在腫瘤免疫中的關鍵作用可能揭示新的腫瘤治療策略或改善現有的策略[25]

本研究利用HCC轉錄組數據進行DEGs挖掘和功能富集分析，鑒定出與預后有顯著性差異的基因。此外，細胞外基質、中性粒細胞活化和細胞因子都參與了HCC預后不良的發生。DEGs的鑒定可能為尋找治療HCC的新靶點和新方法提供新的見解[26]。由于HCC 的復雜性，其腫瘤微環境需要由更大的隊列進行更全面的分析，未來還需要更完整的體內體外實驗來探索TME和DEGs影響HCC進展的具體機制，實現積極的健康結果。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突

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Tumor Microenvironment-Related Genes Associated with Prognosis in Hepatocellular Carcinoma

CAI Ye'， DUAN Fangfang2（1. Department of Pharmacy， Jiangxi Children's Hospital； 2. Central Laboratory，Jiangxi Children's Hospital，Nanchang，Jiangxi 33o006，China）

ABSTRACTObjective Hepatocelular carcinoma （HCC） is a common malignancy. Genes related to the tumor microenvironment（TME）areoftencloselyrelated tooverallsurvival（OS）.However，therolesofTME-related genes in HCC have notyetbeen fulyelucidated.This studyaimed toidentifyTME-related genes thatcouldbeused to predictpoor prognosis in patients with HCC.Method The GSE76427 datasetand GPL10558 Platform matrix file inGene Expression Omnibus（GEO）were downloaded.Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）and GeneOntology（GO）analyses were conducted to identifydiferentially expressed genes （DEGs）and explore their potential prognostic value.Result Immune scores were significantly associated with OS and Barcelona Clinic Liver Cancer （BCLC） grade（ plt;0.05 ）. We identified 87 genes in the TME that were significantly correlated with HCC OS（ plt;0.05 ）.Eight of these DEGs， ALOX5AP，bone marow stromal cellantigen 2（BST2），Bruton tyrosine kinase（BTK），CD48，CECR1，CORO1A， DOCK2，and C1orf162 were significantly associated with OS （ plt;0.01 ）.Conclusion We identified two（BST2、BTK） TME-related genes thatweresignificantlyassociatedwithpoorprognosis in HCC，providingatheoretical basis fortreatment.

KEYWORDSdiferentially expressed genes；GEO database；hepatocellular carcinoma；prognosis；tumor microenvironment

（責任編輯 胡安娜）