溫度介導的水稻鐮刀菌群體生物學性狀差異

摘要

Fusarium luffae和F.sulawesiense是引起水稻穗腐病的重要病原物，但其優勢生態位產生的機制仍不明確。本研究通過模擬水稻生育期的高溫環境，明確了鐮刀菌核心群體亞洲鐮刀菌F.asiaticum、藤倉鐮刀菌F.fujikuroi、F.luffae、F.sulawesiense重要生物學性狀響應溫度變化的種間差異。結果表明，所有供試菌株在不同培養基生長的最適溫度均為25℃，高溫對F.sulawesiense的抑制作用最弱;溫度對鐮刀菌分生孢子產生的影響相似，30℃能夠促進F.luffae和F.sulawesiense孢子萌發;水稻種子受到鐮刀菌侵染后萌發率降低，35℃更有助于F.luffae和F.sulawesiense抑制幼苗莖和根的生長;不同菌株合成特異性毒素的最適溫度均為30℃，35℃下F.asiaticum和F.fujikuroi幾乎完全喪失產毒能力。研究結果將為研究全球氣候變暖形勢下水稻鐮刀菌群體變化的預測提供理論依據。

關鍵詞

水稻; 鐮刀菌; 溫度; 生物學性狀

中圖分類號：

S 432.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2024537

Temperaturemediated differences in biological traits among Fusarium species associated with rice

GU Hui1， SHI Jianrong2， QIU Jianbo1，2*， XU Jianhong2*

（1. School of Ocean Food and Biological Engineering， Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222005， China;

2. Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）

Abstract

Fusarium luffae and F.sulawesiense are important pathogens causing rice spikelet rot disease; however， the mechanisms underlying their ecological dominance are still unclear. This study investigated the interspecific differences in key biological traits of four core Fusarium species （F.asiaticum， F.fujikuroi， F.luffae， and F.sulawesiense） in response to elevated temperatures by simulating the conditions during the rice growing season. The results showed that all tested strains exhibited optimal mycelial growth at 25℃ across different media， while F.sulawesiense was the least inhibited under hightemperature stress. Temperature similarly influenced conidial production， with 30℃ promoting the germination of F.luffae and F.sulawesiense conidia. Inoculation with Fusarium strains reduced the germination rate of rice seeds， and 35℃ significantly enhanced the inhibitory effects of F.luffae and F.sulawesiense on seedling stem and root growth. Toxin production by all strains peaked at 30℃， while higher temperatures （35℃） nearly abolished toxigenic activity in F.asiaticum and F.fujikuroi. These findings provide a theoretical basis for predicting the variation in Fusarium community composition in rice under climate warming scenarios.

Key words

rice; Fusarium spp.; temperature; biological traits

水稻是中國最重要的糧食作物之一，60%以上的人口以稻米為主食。因此，水稻高產穩產和質量安全直接關系到國計民生。穗腐病是水稻穗期重要的病害之一，近年來隨著氣候條件和種植模式的變化，發病面積逐年增加，已經成為制約糧食安全的重要因素［1］。感病水稻籽粒通常變色不實，產量和品質下降，且收獲的谷粒常受到真菌毒素的污染。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol， DON）、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol， NIV）、玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEN）和伏馬毒素（fumonisins， FBs）是江蘇地區水稻上最常見的污染毒素，檢出率超過30%，最高濃度達到20 000 μg/kg，同時呈現多種毒素復合污染的特征，嚴重影響水稻產業高質量發展［23］。

水稻穗腐病可以由多種病原真菌侵染造成，例如鐮孢屬Fusarium、鏈格孢屬Alternaria、彎孢屬Curvularia及平臍蠕孢屬Bipolaris等［1，4］。其中，鐮刀菌是穗腐病的優勢病原菌，同時因其易培養、強致病、高產毒等特性，逐漸成為研究熱點。最新的研究發現水稻穗部鐮刀菌存在豐富的多樣性，變紅木賊鐮刀菌復合種（Fusarium incarnatumequiseti species complex， FIESC）、藤倉鐮刀菌復合種（Fusarium fujikuroi species complex， FFSC）和接骨木鐮刀菌復合種（Fusarium sambucinum species complex， FSAMSC）是優勢群體。在種水平上，FIESC成員F.sulawesiense和F.luffae是優勢種，分離頻率高于常見的水稻病原菌亞洲鐮刀菌F.asiaticum和藤倉鐮刀菌F.fujikuroi［3］。FIESC一直以來被認為是腐生菌，很少與重要的糧食作物病害相關，僅被報道侵染作物的根系或幼苗［5］。最新研究證明了該復合種菌株不能造成小麥和玉米的典型癥狀，但其侵染水稻穗部進而引起穗腐的能力與F.asiaticum和F.fujikuroi沒有顯著性差異，這可能是其在稻穗高頻發生的一個原因［3］。

已有研究表明，溫度是影響鐮刀菌生長和代謝的重要因素［67］。一般認為25℃是多數鐮刀菌培養的最適溫度，但是不同種甚至同一個種的不同來源菌株對溫度的適應性也存在差異［8］。Cendoya等［9］發現溫度變化對阿根廷麥粒分離的層出鐮刀菌F.proliferatum菌株的生長沒有太大的影響，但是不同菌株合成伏馬毒素的最適條件存在差異。環境不僅影響單一菌株，還可能直接改變谷物中病原菌的組成及優勢種的種群結構。Backhouse利用經典的生態位模型——Bioclim模型發現溫度是影響鐮刀菌在全球分布的關鍵參數［10］。歐洲谷物中禾谷鐮刀菌F.graminearum取代黃色鐮刀菌F.culmorum，可能與逐漸升高的溫度有關［11］。年均氣溫也影響了FSAMSC菌株在中國小麥產區的地理分布差異，F.graminearum和F.asiaticum主要分布在寒冷和溫暖的區域，而且F.asiaticum DON化學型群體的致病力、產毒力、生長速率等性狀均顯著強于NIV化學型群體［12］。FIESC菌株對環境因素響應的研究較少，Marín等［13］發現木賊鐮刀菌F.equiseti在25℃時生長速率最高，而35℃時則誘導毒素合成基因的表達。深化該復合種菌株的相關研究，有助于完善病原菌的生活史以及對該病害發生規律的了解。

水稻穗期高濕環境可能影響了葉際鐮刀菌的組成。因此，本研究擬明確水稻主要鐮刀菌在不同溫度時營養生長、無性繁殖、對種子致病力及次生代謝等生物學性狀差異，以明確高溫脅迫對鐮刀菌種群組成的影響，為水稻病害的測報與防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

F.asiaticum、F. fujikuroi、F. luffae和F.sulawesiense均為來自江蘇不同地區感染穗腐病水稻樣品的單孢分離物，-80℃保存在30%的甘油中。每個種分別選取3個菌株，前期已經證實可以引起水稻穗腐病［3］。

1.2 供試培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar， PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水補足至1 L。水瓊脂培養基：瓊脂粉20 g，蒸餾水補足至1 L。綠豆湯培養基：綠豆10 g，蒸餾水煮沸使綠豆開花，4層紗布過濾，蒸餾水補足至1 L。水稻瓊脂培養基：干燥的稻谷磨碎過篩，稱取10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水補足至1 L。水稻秸稈瓊脂培養基：干燥的稻稈磨碎過篩，稱取10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水補足至1 L。上述培養基121℃高溫高壓滅菌20 min，備用。大米培養基： 30 g新鮮干凈的大米加入到150 mL 錐形瓶中，加入10 mL滅菌水，121℃高溫高壓滅菌1 h，搖勻備用。

1.3 不同溫度下菌絲生長測定

供試菌株接種于PDA培養基進行活化，25℃培養3 d，用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌碟，分別接種于PDA、水稻瓊脂、水稻秸稈瓊脂培養基，置于25、30℃和35℃恒溫培養箱中培養，每處理重復3次。每24 h觀察菌落生長狀況，待25℃培養的菌落生長至接近培養皿邊緣時，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（最適溫度下菌落直徑-其他溫度下菌落直徑）/最適溫度下菌落直徑×100%。

1.4 不同溫度下分生孢子產生和萌發測定

供試菌株在PDA上活化，25℃培養3 d，用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌碟，接種于50 mL綠豆湯培養基，每瓶5個菌碟，分別置于25、30℃和35℃搖床中175 r/min振蕩培養3 d。用無菌紗布過濾，收集孢子液備用，利用血球計數板計數，統計孢子濃度。每處理重復3次。

將孢子懸浮液濃度調節至1×104個/mL，取50 μL均勻涂布于水瓊脂平板，分別置于25、30℃和35℃下黑暗培養，每處理重復3次。每2 h觀察孢子萌發狀況，8 h后所有平板轉移至4℃冰箱終止萌發。在光學顯微鏡（ECLIPSE E100，日本尼康）下觀察并記錄萌發孢子的數量，每個視野至少觀察100個孢子。

1.5 不同溫度下供試菌株對水稻種子的致病力測定

水稻品種為‘南粳9108’。選取顆粒飽滿、大小均勻的水稻種子利用2%次氯酸鈉溶液進行表面消毒，無菌水清洗2次后，置超凈臺內無菌濾紙上自然晾干。水稻種子經干燥后轉置于含20 mL孢子懸浮液（1×105個/mL）的50 mL錐形瓶中，過夜振蕩培養（25℃，175 r/min），并設置無菌水培養為對照。處理后的水稻種子放置于鋪有2層潤濕無菌濾紙的90 mm培養皿中，培養期間濾紙保持濕潤狀態。每個培養皿放置10粒水稻種子，分別放置于25、30℃和35℃的光照培養箱內培養，每處理重復3次。每天觀察水稻種子狀態，7 d后測量水稻小苗長度、根系長度以及萌發率。

1.6 供試菌株合成毒素的含量測定

將分生孢子懸浮液濃度調節至1×105個/mL，吸取200 μL至滅菌大米培養基，分別置于25、30℃和35℃恒溫培養箱中發酵培養。前7 d每天觀察培養狀況，搖晃三角瓶，確保菌絲均勻分布到大米培養基上。14 d后烘干并磨碎發酵產物，利用前期建立的方法提取和分析毒素含量［14］，計算毒素合成的抑制率。

毒素合成抑制率=（最適溫度下毒素含量-其他溫度下毒素含量）/最適溫度下毒素含量×100%。

1.7 數據統計及分析

利用SPSS 21.0進行單因素方差分析和Tukey法多重比較，比較0.05水平下的差異顯著性，同時使用GraphPad Prism 8繪圖。

2 結果與分析

2.1 溫度對鐮刀菌菌絲生長的影響

供試菌株在不同基質及溫度下培養的生長速率如圖1所示。4種鐮刀菌在不同培養基上菌絲生長最適宜溫度均為25℃，該溫度下菌落直徑顯著大于高溫環境（Plt;0.05）。30℃和35℃時，所有菌株的生長均受到抑制，抑制程度種間存在差異。F.asiaticum對高溫最敏感，30℃和35℃對其生長的抑制效果顯著高于其他種（Plt;0.05）。F.sulawesiense更適應炎熱環境，菌絲生長受高溫的影響較小。

2.2 溫度對鐮刀菌分生孢子產生和萌發的影響

相同培養條件下，F.fujikuroi的無性生殖能力最強，而F.asiaticum的產孢量最低。所有菌株在25～30℃均能產生大量的分生孢子，適宜孢子的產生，產孢量無顯著差異（Pgt;0.05）;35℃不利于產孢，產孢量顯著低于其他溫度（Plt;0.05）（圖2a）。

供試菌株的分生孢子在不同溫度下的萌發率如圖2b所示，F.fujikuroi和F.asiaticum孢子萌發的最適溫度是25℃，隨著培養溫度的升高，萌發率逐漸降低。30℃時F.luffae和F.sulawesiense的孢子萌發率顯著提高，35℃時的萌發率最低（Plt;0.05）。

2.3 溫度對鐮刀菌致病力的影響

所有參試鐮刀菌的侵染均能降低水稻種子的萌發率。F.fujikuroi、F.luffae和F.sulawesiense在不同溫度下水稻種子的萌發率無顯著性差異（Pgt;0.05）。25℃有利于F.asiaticum的侵染，該溫度時的水稻種子萌發率顯著低于30、35℃（Plt;0.05） （圖3a）。

鐮刀菌侵染降低水稻種子萌發后的莖長和根長（圖3b～d）。所有處理中30℃時的莖長顯著大于其他溫度（Plt;0.05），25℃時莖長最短。F.asiaticum和F.fujikuroi分別在25℃和30℃時對莖長的抑制率最高，而F.luffae和F.sulawesiense則在35℃時對莖長的抑制率最高（圖3e）。所有處理中25℃和30℃時水稻種子萌發的根系長度相近，顯著大于35℃（Plt;0.05）。F.asiaticum在30℃，F.fujikuroi在25℃和30℃時對根長的抑制率最高，而F.luffae和F.sulawesiense則在35℃時更能發揮抑制根系生長的能力（圖3f）。

2.4 溫度對鐮刀菌毒素合成的影響

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）及其衍生物3乙酸基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3ADON）是F.asiaticum在大米基質發酵的主要產物，30℃是代謝產物累積的最適條件，35℃完全抑制了毒素的產生（圖4a）。25℃和30℃時，F.fujikuroi接種大米培養基后的伏馬毒素B1（FB1）和伏馬毒素B2（FB2）濃度分別超過140 000 μg/kg和30 000 μg/kg，在35℃時濃度低于20 μg/kg（圖4b）。F.luffae和F.sulawesiense離體培養主要合成雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）及鐮刀菌烯醇（4ANIV），均表現出類似的溫度響應。毒素含量在25℃和30℃時相近，但在35℃時顯著降低（Plt;0.05） （圖4c，d）。

3 結論與討論

FIESC是亞洲和南美地區水稻上的優勢群體［3，1516］，同時已經成為水稻穗腐病的重要病原。該復合種的菌株在小麥和玉米穗部的分離頻率極低，FIESC可能存在對水稻的寄主偏好［17］，另一種解釋是水稻穗期的小環境對葉際鐮刀菌組成的篩選機制。因此，本文模擬田間高溫環境，評價鐮刀菌不同種的適合度在特定條件下的變化，以期為水稻穗部鐮刀菌特異性組成的解釋提供理論依據。

溫度是影響鐮刀菌菌絲生長以及孢子萌發，進而影響田間侵染寄主的重要因素［18］。前期的研究發現，25～30℃是F.asiaticum和F.fujikuroi菌絲生長的最適溫度［7，19］。F.luffae和F.sulawesiense的相關研究目前還比較缺乏，但是同一復合種的變紅鐮刀菌F.incarnatum在25℃時的菌絲生長速率最高［2021］。本研究的結果是對已有報道的一個驗證，同時發現所有供試菌株生長繁殖的適宜條件基本一致。不同種在同一溫度下的生長存在差異，或者對溫度的敏感性有差別。例如，巴西玉米鐮刀菌群體生長的適宜溫度均為25℃，但是在該條件下F.graminearum的生長速率顯著高于南方鐮刀菌F.meridionale，對溫度變化的響應最激烈［22］。F.asiaticum在所有培養基質中的生長受高溫的抑制更顯著，且在35℃時的生長非常有限，相對應的是F.sulawesiense在溫度波動時的生長狀況更穩定，表明這可能是菌株自身特性。具有更高溫度適應性的物種擅長生態位競爭，F.meridionale在巴西玉米穗腐病病原的優勢地位就和這一因素有關［22］。一般認為，鐮刀菌無性繁殖的最適溫度為25～30℃［23］，所有種在該溫度范圍內產孢量最大。孢子萌發后形成的芽管是穿透植物細胞引起危害的先決條件，F.luffae和F.sulawesiense孢子萌發的適宜溫度與水稻生育期的高溫環境相吻合，這一特性有利于FIESC菌株在穗部的定殖與侵染，從而在空間競爭中處于有利地位。

鐮刀菌致病過程的適宜溫度存在種間差異［24］，當地氣候條件下強致病力的菌株在進化中成為優勢種［25］。本研究利用病原菌侵染水稻種子模擬田間過程，發現種子萌發后莖長和根長的影響是菌株和環境因素共同決定的。單獨分析溫度的影響，F.luffae和F.sulawesiense在高溫時對水稻莖和根生長的抑制作用更顯著。自然環境下，多種病原菌復合侵染是很常見的現象。因此，通過復合和順序接種與單一接種結果的比較，可以為FEISC菌株的競爭性提供依據。DON、NIV和FBs一直以來被認為是鐮刀菌致病關鍵因子，在其侵染寄主的過程中發揮著重要作用［2628］。本研究中F.asiaticum和F.fujikuroi代謝響應溫度的趨勢與前期的研究結論一致［67］，但在35℃時幾乎所有菌株都已經喪失了毒素合成的能力，削弱了其在病菌致病過程中的作用。環境因子對FIESC毒素產生的調控目前尚不清晰，F.equiseti單端孢霉烯合成基因（Tri5）在35℃時高度誘導表達，但沒有檢測該類毒素的合成量［13］。F.luffae和F.sulawesiense產生的毒素含量在試驗溫度范圍內的波動幅度小于其他參試菌種，顯示出更高的溫度適應性。

本研究明確了溫度對水稻鐮刀菌重要生物學性狀的影響，鑒于目前全球變暖的態勢及可能隨之而來的病原菌種群結構變化和真菌毒素污染加劇，相關結果可以為防控穗腐病的發生預測提供數據支撐。病原菌和寄主在自然界的相互作用過程離不開環境的參與，溫度、濕度、光照、空氣、酸堿度等多種因子可能同時發揮作用，因此相關因素對FIESC菌株生長代謝的調控是下一步研究重點。

參考文獻

［1］ 黃世文， 王玲， 劉連盟， 等. 水稻穗腐病病原分離、鑒定及生物學特性［J］. 中國水稻科學， 2012， 26（3）： 341350.

［2］ DONG Fei， XING Yujun， LEE Y W， et al. Occurrence of Fusarium mycotoxins and toxigenic Fusarium species in freshly harvested rice in Jiangsu， China ［J］. World Mycotoxin Journal， 2020， 13（2）： 201212.

［3］ QIU Jianbo， GU Hui， WANG Shufang， et al. A diverse Fusarium community is responsible for contamination of rice with a variety of Fusarium toxins ［J/OL］. Food Research International， 2024， 195： 114987. DOI： 10.1016/j.foodres.2024.114987.

［4］ 張亞玲， 付忠舉， 李雪， 等. 黑龍江， 四川和海南省稻作區水稻穗腐病病原比較分析［J］. 中國農業科學， 2024， 57（2）： 278294.

［5］ BARROS G， ZANON M S A， PALAZZINI J M， et al. Trichothecenes and zearalenone production by Fusarium equiseti and Fusarium semitectum species isolated from Argentinean soybean ［J］. Food Additives amp; Contaminants： Part A， 2012， 29（9）： 14361442.

［6］ HUANG Wenwen， ZHOU Ping， SHEN Guanghui， et al. Relationship between mycotoxin production and gene expression in Fusarium graminearum species complex strains under various environmental conditions ［J］. Journal of Microbiology， 2023， 61（5）： 525542.

［7］ DONG Ting， QIAO Shouning， XU Jianhong， et al. Effect of abiotic conditions on growth， mycotoxin production， and gene expression by Fusarium fujikuroi species complex strains from maize ［J/OL］. Toxins， 2023， 15（4）： 260. DOI： 10.3390/toxins15040260.

［8］ 紀莉景， 栗秋生， 王亞嬌， 等. 溫度對假禾谷鐮刀菌生長、侵染及莖基腐病發生的影響［J］.植物病理學報， 2020， 50（6）： 723730.

［9］ CENDOYA E， DEL PILAR MONGE M， CHIACCHIERA S M， et al. Influence of water activity and temperature on growth and fumonisin production by Fusarium proliferatum strains on irradiated wheat grains ［J］. International Journal of Food Microbiology， 2018， 266： 158166.

［10］BACKHOUSE D. Global distribution of Fusarium graminearum， F.asiaticum and F.boothii from wheat in relation to climate ［J］. European Journal of Plant Pathology， 2014， 139（1）： 161173.

［11］PARIKKA P， HAKALA K， TIILIKKALA K. Expected shifts in Fusarium species’composition on cereal grain in Northern Europe due to climatic change ［J］. Food Additives amp; Contaminants： Part A， 2012， 29（10）： 15431555.

［12］ZHANG Hao， VAN DER LEE T， WAALWIJK C， et al. Population analysis of the Fusarium graminearum species complex from wheat in China show a shift to more aggressive isolates ［J/OL］. PLoS ONE， 2012， 7（2）： e31722. DOI： 10.1371/journal.pone.0031722.

［13］MARN P， JURADO M， GONZALEZJAEN M T. Growth rate and TRI5 gene expression profiles of Fusarium equiseti strains isolated from Spanish cereals cultivated on wheat and barley media at different environmental conditions ［J］. International Journal of Food Microbiology， 2015， 195： 4047.

［14］QIU Jianbo， LU Yunan， HE Dan， et al. Fusarium fujikuroi species complex associated with rice， maize， and soybean from Jiangsu province， China： phylogenetic， pathogenic， and toxigenic analysis ［J］. Plant Disease， 2020， 104（8）： 21932201.

［15］MOREIRA G M， NICOLLI C P， GOMES L B， et al. Nationwide survey reveals high diversity of Fusarium species and related mycotoxins in Brazilian rice： 2014 and 2015 harvests ［J/OL］. Food Control， 2020， 113： 107171. DOI： 10.1016/j.foodcont.2020.107171.

［16］TRALAMAZZA S M， PIACENTINI K C， SAVI G D， et al. Wild rice （O.latifolia） from natural ecosystems in the Pantanal region of Brazil： Host to Fusarium incarnatumequiseti species complex and highly contaminated by zearalenone ［J/OL］. International Journal of Food Microbiology， 2021， 345： 109127. DOI： 10.1016/j.ijfoodmicro.2021.109127.

［17］YANG Meixin， ZHANG Hao， KONG Xiangjiu， et al. Host and cropping system shape the Fusarium population： 3ADONproducers are ubiquitous in wheat whereas NIVproducers are more prevalent in rice ［J/OL］. Toxins， 2018， 10（3）： 115. DOI： 10.3390/toxins10030115.

［18］BEYER M， RDING S， LUDEWIG A， et al. Germination and survival of Fusarium graminearum macroconidia as affected by environmental factors ［J］. Journal of Phytopathology， 2004， 152（2）： 9297.

［19］CERVINI C， NAZ N， VERHEECKEVAESSEN C， et al. Impact of predicted climate change environmental conditions on the growth of Fusarium asiaticum strains and mycotoxins production on a wheatbased matrix ［J/OL］. International Journal of Food Microbiology， 2024， 416： 110658. DOI： 10.1016/j.ijfoodmicro.2024.110658.