健脾和胃方的指紋圖譜、化學模式識別分析及多指標含量測定

中圖分類號R284;R917 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1876-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.10

Fingerprints，chemical pattern recognition analysis，and multi-index content determinationof Jianpi hewei formula

HE Dongdong'，ZONG Hui’，WANG Chongyang'，WAN Juanjuan'，MAO Xuepu'，HUANG Chuansheng2，WANG Xinchun2，WANG Liping1（1. Schoolof Pharmacy，Shihezi University/Key Laboratoryof Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization，Ministry of Education，Xinjiang Shihezi 832002，China;2.Dept.of Pharmacy，the First Afliated Hospital of Shihezi University，Xinjiang Shihezi 8320o8，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToestablish HPLC fingerprint forJianpi hewei formula（JPHWF），conductchemical paterm recognitionanalysis，anddeterminethecontentsof sevencomponentsintheformula，aiming toprovideascientificbasis for qualitycontrol and furtherresearch ofJPHWFMETHODS Taking15batchesof standard decoctionsof JPHWFassamples，the HPLCfingerprintwasestablishedusingtheSimilarityEvaluationSystemofTCMChromatographicFingerprint（2O12edition）. Subequently，similarityevaluation，aswellasidentificationandatributionanalysisofchromatographicpeaks，wereconducted. Using thecommon peak areasfromthe15 batches of samples as variables，chemical paternrecognition analyses were performed onthesamplestrougherarhicalcusteranalysis，priipalcomponentanalysis，andrthogonalpartialleastsqares-dsriiant analysis.Thecontentsofadenine，5-hydroxymethylfurfural，tetrahydropalmatine，naringin，dehydrocorydaline，neohesperidinand glycyrhizicacidin15batchesofsamples weredeterminedbyHPLC.RESULTSTherewere19commonpeaks inthecharacteristic chromatograms for15batchesofsampleswiththesimilaritesofmorethanO.95.Resultsofchemicalpattmrecognitionanalysis showedhat15batchesofsamplescouldbeclusteredinto3categories，and3diferentialcompoundswerefound[peak7（5- hydroxymethylfurfural）），peak17（nohesperidin），andpeak15（naringin）.The7components werelinearlygoodintherespective concentration ranges R²≥0.9994 ）；RSDs of precision，stability and repeatability tests were less than 2% 0 n=6 ）；the average recovery rate of 98.95%-103.81% ，RSDof 0.61%-2.75% （ n=6 ）；the contents of them were 0.031-0.106，0.267-0.824，0.089- 0.144，1.344-2.091，0.089-0.178，1.328-2.028， 0.040-0.150mg/g ，respectively. CONCLUSIONS Established HPLC fingerprinting methodoupledwithmult-indexcontentdeterminationisvalidatedtobeaccurateandreliable，anditscombinationwithchemical

pattern recognition analysis can be applied to the quality control of JPHWF.

KEYWORDS Jianpi hewei formula；fingerprint；chemical constituents； contentdetermination；hierarchical cluster analysis；principal componentanalysis；orthogonal partial least squares-discriminantanalysis

慢性胃炎是一種胃黏膜的慢性炎癥性疾病，發病機制復雜，涉及幽門螺桿菌感染、不良飲食習慣及遺傳因素等多重誘因。該病在病理學上可表現為胃黏膜萎縮，并伴隨腸上皮化生和異型增生等癌前病變特征，與胃癌的發生呈顯著正相關。對于慢性胃炎，現代醫學自前尚缺乏針對性的治療方案，患者病情常反復發作、遷延不愈。中醫藥干預通過多靶點作用機制，可以部分逆轉相關病理改變，且毒副作用小，適合長期治療[3]

中醫將慢性胃炎歸屬于“胃皖痛”“胃痞\"等范疇，認為慢性胃炎是由脾胄虛寒導致的。健脾和胃治法針對脾胃虛弱、脾胃不和，采用補益脾氣的中藥，調和脾胃之氣，可以達到脾升胃降的作用。健脾和胃方是石河子大學第一附屬醫院中醫科治療慢性胃炎的臨床經驗方，由黨參、白術、木香、莪術、焦麥芽、焦神曲、焦山楂、枳殼、延胡索和甘草10味中藥組成，具有健脾和胃、補益脾氣的功效。該方已被臨床證實對慢性胃炎具有良好的治療效果，特別是對慢性萎縮性胃炎、胃癌前病變療效顯著。但目前針對該方的質量控制尚無系統研究，導致其質量控制標準不統一。

中藥指紋圖譜可以從整體上宏觀地表征中藥主要化學成分[6-7];；層次聚類分析（hierarchicalclusteranaly-sis，HCA）、主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（orthogonalpartialleastsquares-discriminantanalysis，OPLS-DA）等化學模式識別技術結合指紋圖譜已被廣泛應用于中藥復方的質量控制和評價[8-9]。因此，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法建立健脾和胃方的指紋圖譜，并結合化學模式識別技術進行分析，同時對其中7種主要成分（腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸）進行含量測定，旨在為其質量控制、醫院制劑開發和臨床應用提供數據支撐。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用的主要儀器有：1260InfinityⅡ型HPLC儀（美國Agilent公司）KH-300DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）BAS224S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]、XW-80A型旋渦混合器（上海馳唐電子有限公司）、Fresco21型高速冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.2主要藥品與試劑

對照品腺嘌呤（批號MUST-23103001）5-羥甲基糠醛（批號MUST-23102711）延胡索乙素（批號MUST-24022721）柚皮苷（批號MUST-24033001）脫氫紫堇堿（批號MUST-23071017）、新橙皮苷（批號MUST-23100812）、甘草酸（批號MUST-23110110）均購自曼斯特（成都）生物科技有限公司，純度均不低于 98% ;乙腈、甲醇和磷酸均為色譜級。

1.3中藥飲片

黨參（批號DS231101、DS231002，產地甘肅）、白術（批號BZ231002，產地安徽；批號BZ240101，產地四川）木香（批號MX231101、MX221001，產地云南）、積殼（批號ZK231001，產地江西；批號ZK240101，產地四川）、莪術（批號EZ230701，產地廣西；批號EZ230201，產地四川）、焦麥芽（批號JMY210101，產地安徽；批號JMY220901，產地四川）焦神曲（批號JSQ210701，產地安徽；批號JSQ231001，產地四川）、焦山楂（批號JSZ210401，產地山東；批號JSZ230901，產地河北）延胡索（批號YHS230602、YHS230703，產地浙江）和甘草（批號GC231001，產地甘肅；批號GC231201，產地新疆）均購自毫州市善安堂中藥飲片公司或四川國強中藥飲片公司，經石河子大學第一附屬醫院藥學部王彪主管藥師鑒定均為真品。

2方法與結果

2.1 色譜條件

采用WatersSymmetry C₁₈ 柱 250mm×4.6mm， μm） ，以乙腈（A） .0.1% 磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（ 0～15min ， 2%A?10%A 15～30min ， 10%A? 35%A 30～40min 35%A?80% ； 40～50min 80%A 2%A ）；檢測波長為 254nm ；柱溫為 35^°C ；流速為1mL/min ；進樣量為 10μL 。

2.2 溶液制備

2.2.1 健脾和胃方標準湯劑制備

取黨參 10g 白術 10g 木香 3g 枳殼 10g 焦三仙（焦麥芽、焦神曲、焦山楂）各 10g 莪術 6g 、延胡索 26g 、甘草 3g ，加8倍量水，首次冷浸 0.5h ，煎煮 ，紗布過濾；第2次加人6倍量水，煎煮 40min ，紗布過濾；合并2次濾液，減壓濃縮至 500mL ，即得健脾和胃方標準湯劑，備用。15批次健脾和胃方樣品（編號 S1～S15 由各單味飲片采用隨機數表法組合而得（具體組合信息可掃描本文首頁二維碼，進入“增強出版\"頁面查看附表1）。

2.2.2 混合對照品溶液制備

精密稱取腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮昔和甘草酸對照品，用 50% 甲醇溶解制成質量濃度分別為 0.51，5.04，5.12，5.08，5.20， 0.52，5.02mg/mL 的單一對照品溶液。分別精密移取上述各單一對照品溶液適量，用 50% 甲醇稀釋并定容至同一 5mL 容量瓶中，得上述7種成分質量濃度分別為50.47、199.27，198.69，396.26，99.77，297.61，199.40μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

精密量取健脾和胃方標準湯劑 750μL ，加 750μL 甲醇，超聲 10min ，以 14000r/min 離心 10min ，取上清液經 0.22μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.4單味飲片對照溶液、缺味陰性樣品溶液制備

取處方量的飲片，按“2.2.1\"項下方法制備單味飲片對照溶液和缺味陰性樣品溶液。

2.3 指紋圖譜的建立及分析

2.3.1 方法學考察

（1）精密度：取健脾和胃方樣品（編號S3），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按\"2.1\"項下色譜條件連續進樣測定6次。以15號峰（柚皮昔）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積，其RSD分別小于 0.61% 和 1.94%（n=6） ，表明方法精密度良好。

（2）穩定性：取健脾和胃方樣品（編號S3），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在室溫下分別放置0、2、4、6、8、10、12、24h時，按“2.1\"項下色譜條件進樣測定。以15號峰（柚皮昔）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積，其RSD分別小于 1.10% 和 2.93%（n=8） ，表明供試品溶液在室溫放置 24h 內穩定性良好。

（3）重復性：取健脾和胃方樣品（編號S3），按\"2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按\"2.1\"項下色譜條件進樣測定。以15號峰（柚皮昔）為參照峰，計算各特征峰相對保留時間和相對峰面積，其RSD分別小于 0.61% 和 1.71%（n=6） ，表明方法重復性良好。

2.3.2 指紋圖譜建立及相似度評價

取15批健脾和胃方樣品（編號 S1～S15 ，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄HPLC色譜圖。將相關色譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》，選取編號S3樣品的圖譜為參照圖譜，設置時間窗寬度為0.1min，采用中位數法，進行多點校正和全峰匹配，生成15批樣品的疊加指紋圖譜及其對照譜圖R，詳見圖1。以對照圖譜R為參照，計算15批健脾和胃方樣品圖譜的相似度。結果顯示，15批樣品共標定出19個共有峰；15批樣品圖譜與對照圖譜R的相似度在 0.956～0.998 之間，均大于0.95，表明不同批次樣品間具有高度相似性。

圖115批樣品的HPLC疊加指紋圖譜及其對照圖譜R

2.3.3 共有峰的指認及歸屬

將健脾和胃方供試品溶液（編號S3）圖譜與混合對照品溶液圖譜（取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定所得）進行比對，共指認出7個色譜峰，分別是1號峰腺嘌呤、7號峰5-羥甲基糠醛、10號峰延胡索乙素、15號峰柚皮苷、16號峰脫氫紫堇堿、17號峰新橙皮苷和19號峰甘草酸。將健脾和胃方供試品溶液（編號S3）圖譜與單味飲片對照溶液圖譜、缺味陰性樣品溶液圖譜（分別取“2.2.4”項下單味飲片對照溶液、缺味陰性樣品溶液按“2.1\"項下色譜條件進樣測定所得）進行比對可知， 1～4 號峰為各飲片水煎液共有；7號峰和8號峰歸屬于焦三仙（焦麥芽、焦神曲、焦山楂）；9號峰歸屬于莪術；10、11、13、14和16號峰歸屬于延胡索；12和19號峰歸屬于甘草；15、17和18號峰歸屬于積殼；5號峰歸屬于白術和木香；6號峰歸屬于黨參和白術。結果見圖2、圖3。

圖2供試品溶液、混合對照品溶液及各單味飲片對照溶液的HPLC疊加圖

2.4 化學模式識別分析

2.4.1 HCA

將15批樣品的共有峰峰面積導入SPSS22.0軟件，采用組間連接、平方歐氏距離法進行HCA。結果（圖4）顯示，當平方歐氏距離為15時，15批樣品可聚為3大類：編號為 S4～S5.S7～S8.S11～S12…S15 的樣品聚為第1類；編號為S9的樣品為第2類；編號為 S1～S3.S6.S10Ω， S13～S14 的樣品聚為第3類。該結果表明，各批次樣品的成分有一定差異。

2.4.2 PCA

以15批樣品的共有峰峰面積為變量，將其導入SIMCA14.1軟件進行PCA。以特征值 gt;1 為篩選標準，共得到5個主成分，其累積方差貢獻率為 85.446% （第1主成分的方差貢獻率為 32.350% ，第2主成分的方差貢獻率為 21.295% ，第3主成分的方差貢獻率為 12.310% ，第4主成分的方差貢獻率為 10.394% ，第5主成分的方差貢獻率為 9.097% ），可反映15批樣品的主要信息。其中，第 1～5 主成分中方差貢獻率較高的成分分別為峰16（脫氫紫堇堿）峰6、峰18、峰17（新橙皮苷）和峰19（甘草酸）。PCA得分圖（圖5）顯示，15批樣品可分為3類：編號為 S1～S2，S5，S11～S12 的樣品聚為第1類；編號為 S6～S9 的樣品聚為第2類；編號為 S3～S4，S10 S13～S15 的樣品聚為第3類。該結果與HCA結果相近。其中，PCA的主成分由全體變量共同貢獻，HCA結果可能由某些高方差變量主導，最終導致二者聚類結果略有不同。

圖415批樣品的HCA樹狀圖

圖515批樣品的PCA得分圖

2.4.3 OPLS-DA

以15批樣品的共有峰峰面積為變量，將其導入SIMCA14.1軟件進行OPLS-DA。該模型穩定性參數R²Y=0.794 ，預測參數 Q²=0.615 ，均大于0.5，表明建立的OPLS-DA模型具有較高的穩定性與較好的預測能力。OPLS-DA得分圖（圖6A）顯示，15批樣品可分為3類：編號為 的樣品聚為第1類；編號為S2、S6、S9的樣品聚為第2類；編號為 S4～S5，S7～ S8…S11～S12， S15的樣品聚為第3類。該結果與HCA結果相近。

本研究以變量重要性投影（variableimportance inprojection，VIP）值 gt;1 為標準，共篩選出3個差異性成分，分別為峰7（5-羥甲基糠醛）峰17（新橙皮苷）和峰15（柚皮昔），詳見圖6B。

圖615批樣品的OPLS-DA得分圖和VIP得分圖

2.5 多指標成分含量測定

2.5.1 專屬性考察

取空白溶劑（ 50% 甲醇）混合對照品溶液和供試品溶液（編號S1），分別按\"2.1\"項下色譜條件進樣測定。結果（圖7）顯示，供試品溶液和混合對照品溶液中7個成分的保留時間一致，7個成分的色譜峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，理論板數以各待測成分峰計均不低于5000，且空白溶劑不干擾測定，說明該方法專屬性良好。

圖7空白溶劑、混合對照品溶液和供試品溶液的HPLC色譜圖

2.5.2 線性關系考察

精密吸取“2.2.2\"項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋2、5、10、50、100倍，取混合對照品原溶液及系列稀釋液，分別按\"2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各成分質量濃度為橫坐標 （X） 、峰面積為縱坐標 （Y） 進行線性擬合。結果（表1）顯示，各成分在其進樣質量濃度范圍內線性關系均良好。

表1各成分的線性關系考察結果

2.5.3 精密度考察

精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋5倍后，按\"2.1\"項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸峰面積的RSD分別為 0.05% 、 0.08% 0.73% / 0.63% / 0.32% / 0.69% 和0.83%（n=6） ，表明儀器精密度良好。

2.5.4穩定性考察

取編號S1樣品，按\"2.2.3\"項下方法制備供試品溶液，分別在室溫下放置 0.2，4，8，12，24h 時，按“2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸峰面積的RSD分別為 1.11%.0.50%.0.56% 1.04%.1.47%.0.48% 和 1.16%（n=6） ，表明供試品溶液在室溫放置24h內穩定良好。

2.5.5 重復性考察

按\"2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液（編號S1），分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用外標法計算各成分含量。結果顯示，腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸含量的RSD分別為 0.71%.0.60%.0.78% 0.57%.0.61%.0.87% 和 0.69%（n=6） ，表明該方法重復性良好。

2.5.6加樣回收率考察

精密量取6份已知成分含量的健脾和胃方標準湯劑（編號S1），每份 2mL ，按標準湯劑中已知成分含量1：1的比例加入各單一對照品溶液適量，按\"2.2.3\"項下方法制備供試品溶液，按\"2.1\"項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算各成分的平均加樣回收率。結果顯示，腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸的平均加樣回收率分別為98.95%_～100.72%_～100.60%_～103.81%_～100.85%_～100.23% 和 99.23% ，RSD分別為 1.28%，1.26%，1.10%，0.66% /0.61% 、 0.73% 和 2.75% （ n=6 ，表明該方法的準確度較高。

2.5.7 樣品含量測定

取15批次樣品，分別按\"2.2.3\"項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并采用外標法計算各成分含量。每批樣品平行測定3次，取平均值。結果（表2）顯示，15批樣品中腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮昔、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸含量范圍分別為 0.031～0.106，0.267～0.824，0.089～ 0.144、1.344～2.091、0.089～0.178、1.328～2.028、0.040～0.150mg/g 。

表215批樣品中各成分的含量測定結果 ?（n=3，mg/g）

3討論

3.1 健脾和胃方的方解

健脾和胃方由黨參、白術、木香、莪術、焦三仙（焦麥芽、焦神曲、焦山楂）、枳殼、延胡索和甘草10味中藥組成，對慢性胃炎具有良好的臨床療效。方中，黨參歸脾、肺二經，能補脾養胃，為補中益氣的良藥[；白術甘溫補虛、苦溫燥濕，既能補氣以健脾，又能燥濕，炒用補氣健脾效果明顯[]，二者共為君藥。木香辛溫，具有溫中和胃、健脾消滯之功效[2，為臣藥。莪術味苦、辛，性溫，具有行氣、破血、消積、止痛的功效3；焦三仙具有消脹除滿、通暢胃腑的功效；枳殼味苦，性微寒，具有理氣寬中、行滯消脹之功效[4；延胡索性溫，味辛、苦，是活血化瘀、行氣止痛之妙品[15]，六者共為佐藥。甘草調和諸藥，疏肝行氣[，為使藥。10味中藥共奏健脾和胃、理氣通滯之效，達到治療慢性胃炎的效果。

3.2 色譜條件的優化

本課題組在實驗前期優化了HPLC色譜條件，考察了不同流動相（甲醇-水、甲醇- .0.1% 磷酸溶液、乙腈 .0.1% 磷酸溶液）、柱溫 （35，40，45^°C ）和流速（0.8、1.0、1.2mL/min 對該方化學成分分離效果、峰形等的影響，結合全波長掃描，最后確定了本研究中的色譜條件。在該色譜條件下，色譜峰的峰形和分離度良好，保證了分析方法的準確性和可靠性。

3.3 指紋圖譜分析

本研究基于HPLC法對健脾和胃方標準湯劑進行了指紋圖譜研究，不同批次樣品的指紋圖譜相似度均在0.95以上，表明不同批次飲片的整體質量較穩定。指紋圖譜中共標定了19個共有峰，通過與混合對照品溶液圖譜比對確定了其中7個主要成分，分別是腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸。并且，筆者通過與缺味陰性樣品溶液和單味飲片對照溶液色譜圖進行對比，明確了7種成分的藥材歸屬，為揭示健脾和胃方的藥效物質基礎提供了參考。然而，本研究中用于指紋圖譜建立的飲片樣本量有限，后續在醫院制劑開發和申報過程中有必要進一步增加飲片樣本量，建立更加完善的質量控制體系。

3.4化學模式識別的結果分析

本研究使用SPSS22.0、SIMCA14.1軟件對15批樣品進行HCA、PCA和OPLS-DA。HCA、PCA和OPLS-DA均將15批樣品聚為3大類，表明各批次樣品的成分有一定差異。以VIP值 gt;1 為標準篩選出3個差異性成分，分別為峰7（5-羥甲基糠醛）峰17（新橙皮苷）和峰15（柚皮苷）；其中峰17（新橙皮苷）在PCA中為第4主成分中方差貢獻率較大的化合物，其余2個差異性成分未被主成分捕獲，說明類別差異可能隱藏在次要方差中。

3.5含量測定成分選取依據及結果分析

腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮苷、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸是健脾和胃方樣品HPLC色譜圖中響應較高的成分，且多是該方中藥材在2020年版《中國藥典》（一部）中收載的用于含量測定的指標性成分，因此本研究將其作為定量分析指標。如柚皮昔和新橙皮苷是積殼的指標成分，具有促進胃腸運動和抗潰瘍的作用[1；延胡索乙素是延胡索的指標成分，具有鎮靜、止痛等作用；甘草酸為甘草的特征性活性成分，具有抗炎、調節免疫的作用；腺嘌呤、5-羥甲基糠醛和脫氫紫堇堿都具有抗炎、抗腫瘤等作用[20-22]。以上7種成分可能是健脾和胃方發揮治療慢性胃炎作用的重要物質，因此本研究對這7種成分進行了含量測定。含量測定結果顯示，15批樣品中腺嘌呤、5-羥甲基糠醛、延胡索乙素、柚皮昔、脫氫紫堇堿、新橙皮苷和甘草酸的含量范圍分別為 0.031～0.106，0.267～0.824，0.089～0.144，1.344～ 2.091、 0.089～0.178，1.328～2.028，0.040～0.150mg/g 結果提示，7種成分在15批樣品中的含量存在一定差異，這可能與藥材產地、提取工藝或儲存條件有關。

綜上所述，本研究所建立的HPLC指紋圖譜及多指標成分含量測定方法穩定、可行，為揭示健脾和胃方的藥效物質基礎提供了參考，也為健脾和胃方的質量控制、后續醫院制劑開發和臨床應用奠定了基礎。

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（編輯：林靜）