芍藥甘草湯調(diào)控ASIC3/ERK信號(hào)通路改善慢傳輸型便秘大鼠腸道動(dòng)力的機(jī)制研究

中圖分類號(hào)R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào) 1001-0408（2025）15-1852-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.06

Study on the mechanism of Shaoyao gancao decoction in improving intestinal motility in rats with slow transit constipation by regulating the ASIC3/ERK signaling pathway

ZHANG Ziqi12，ZHOU Hongyun1，ZHAO Qiong1，2，DENG Yuan3，ZHAO Mengjiel，ZHAO Chen4，CHEN Jingyi1， 2 （1.Dept.of Pediatrics，Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075， China;2.Clinical Medical College，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 6137， China；3.Chongqing College of Traditional Chinese Medicine，Chongqing 402760，China；4.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToexplore the mechanismof Shaoyao gancao decoction inimproving intestinal motilityinrats with slowtransitconstipation（STC）byregulatingacid-sensitiveionchannel3（ASIC3）/extracelularsignal-regulatedkinase（ERK） signaling pathway.METHODS SDratswereused toconstruct anSTC model bygavage withcompound diphenoxylate.The successfully modeled rats were randomly divided into model group， Shaoyao gancao decoction group （1.5g/mL ），lactulose group 0 208.4mg/mL ，positive control），and combined inhibition group（Shaoyao gancao decoction 1.5g/mL⁺ amiloride hydrochloride 20 （204號(hào) μg/kg） ，with12rats ineachgroup.Additionaly，12healthyrats wereselectedastheblank group.They weregivenrelevant medicinonceadayandcontiuouslyintervenedfor14days.Afterintervention，theintestinalpropulsionfunctionandvisceral sensitvityofthemodelratswere detected.TheexpressionofASIC3inthecolontissueofratswasobservedby

immunohistochemical staining.mRNA expressions of ASIC3， ERK1 and ERK2 as well as protein expressions of ASIC3， ERK1/2 and phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） in colon tissueof ratswere detected；the ultrastructural changes of the entericnervoussystem（ENS）-interstitial cell of Cajal （ICC）-smooth muscle cell（SMC）network in the rat colon

wereobservedunderelectronmicroscopy.RESULTS Comparedwiththe model group，the intestinalpropulsionrateof the Shaoyao gancaodcoctiongroup wassignificantlyincreased，whilethevisceralpainthresholdwassignificantlydecreasedTheproportioof thepositiveareaofASIC3 inthecolonic tisse wassignificantlyincreased.Therelative mRNA expressionlevelsofERK1，ERK2， and ASIC3，as wellastherelative protein expresionlevelsof p-ERK1/2andASIC3，andthep-ERK1/2 toERK1/2inthecolonic tissue，were all significantly increased （ ΔPlt;0.05 or Plt;0.01 ）.Additionally，there was marked repair of the morphological structure of ICCandSMC，with closer gap junctions observed.Compared with the Shaoyao gancao decoction group，the combined inhibitiongroupexhibitedadiminishedimprovementinintestinalmotilityofrats，withstatisticallysignificantdierenes nthe levels of some indicators（ Plt;0.05 or Plt;0.01 ）；the repairing of the morphological structure of ICC and SMC was notably atenuated.CONCLUSIONSShaoyaogancaodecoctioncaneffectively improve the intestinal transmission functionandpromote intestinalrepair in STCrats，anditsmechanismmayberelatedtoregulatingthebalanceoftheENS-ICC-SMCnetwork mediated bythe ASIC3/ERK signaling pathway，thus promoting intestinal motility and reducing visceral sensitivity.

KEYWORDSslow transit constipation； Shaoyao gancao decoction； ASIC3； ERK; ENS-ICC-SMC network

功能性便秘是 1～4 歲中國(guó)兒童最常見的功能性胃腸病。慢傳輸型便秘（slowtransitconstipation，STC）是兒童功能性便秘的主要類型，主要表現(xiàn)為結(jié)腸蠕動(dòng)減弱或消失、結(jié)腸排空延遲。STC在全球兒童中的患病率為13%～25% ，且近年患病率仍在升高，其病程較長(zhǎng)且癥狀易反復(fù)，嚴(yán)重影響患兒身心健康和生活質(zhì)量]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療STC的手段相對(duì)單一，缺乏可靠且作用持久的治療方法。中醫(yī)藥治療STC具有安全有效、復(fù)發(fā)率低、作用持久等優(yōu)勢(shì)[3]

芍藥甘草湯首載于《傷寒雜病論》，該方以養(yǎng)陰增液、潤(rùn)腸通便為治療之法。成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院兒科趙瓊教授長(zhǎng)期在臨床實(shí)踐中以酸甘化陰為指導(dǎo)，以生白芍、生甘草為基礎(chǔ)方，在小兒各型便秘，尤其是腸燥津虧型患兒中取得了滿意療效4。本課題組前期臨床研究表明，以芍藥甘草湯為基礎(chǔ)的組方可明顯增加腸燥津虧型便秘患兒的排便頻率，改善糞便性狀，縮短排便時(shí)間，遠(yuǎn)期隨訪療效相對(duì)穩(wěn)定，復(fù)發(fā)率低4，且芍藥-甘草3：1配比療效最佳；同時(shí)前期實(shí)驗(yàn)研究提示，酸敏感離子通道3（acid-sensingionchannel3，ASIC3）在腸道也有表達(dá)，且可能通過影響腸神經(jīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)（entericnervoussystem，ENS），從而促進(jìn)腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)，改善腸道動(dòng)力，其可能在芍藥甘草湯治療STC中發(fā)揮重要作用，這也與芍藥甘草湯酸甘化陰的立方理論不謀而合。然而，芍藥甘草湯治療STC的作用機(jī)制尚未明確，故本研究擬采用復(fù)方地芬諾酯溶液灌胃構(gòu)建STC大鼠模型，探索芍藥甘草湯治療STC的潛在機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療STC提供新參考。

1材料

1.1主要儀器

JEM-1400型透射電子顯微鏡購自日本電子株式會(huì)社；Pannoramic250型數(shù)字切片掃描儀購自匈牙利3DHISTECH公司;SpectraMAXPlus384型酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；D3024R型離心機(jī)購自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司；HH系列-6型恒溫水浴鍋購自上海力辰邦西儀器科技有限公司；SD100型核酸定量?jī)x、BT96G型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）基因擴(kuò)增儀均購自德國(guó)AnalytikJena公司。

1.2 主要藥品與試劑

芍藥甘草湯由生白芍、生甘草組成，這2種飲片購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司（批號(hào)分別為D2209079、2206076），經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院黃勤挽教授鑒定合格，分別為芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根和甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根。

復(fù)方地芬諾酯片（批號(hào)220501，每片含鹽酸地芬諾酯 2.5mg 、硫酸阿托品 25μg 購自廣西河豐藥業(yè)有限責(zé)任公司;乳果糖口服溶液[批號(hào)366197，規(guī)格 （以乳果糖計(jì)）]購自荷蘭Abbott公司;鹽酸阿米洛利（貨號(hào)HY-B0285A，規(guī)格 100mg/ 瓶）購自美國(guó)MCE公司；活性炭、阿拉伯膠（批號(hào)分別為C14358027、C14362403）均購自上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；電鏡固定液購自武漢谷歌生物科技有限公司；兔單克隆ASIC3抗體（批號(hào)ab302776）購自英國(guó)Abcam公司；兔單克隆胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellularsignal-regulatedkinases1/2，ERK1/2）抗體（批號(hào)T40071）、兔單克隆磷酸化ERK1/2（phosphorylatedERK1/2，p-ERK1/2）抗體（批號(hào)TA1015）均購自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（批號(hào)GB23303）兔抗 β -肌動(dòng)蛋白（ -actin）（批號(hào)GB11001）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的（鼠+兔）二抗（批號(hào)BA1056）購自美國(guó)BOSTER公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為4周齡SPF級(jí)SD大鼠，共60只，體重 （70±10）g ，雌雄各半，購自北京斯貝福有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)溫江校區(qū)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼養(yǎng)中心。大鼠飼養(yǎng)在相對(duì)濕度 （55±10）% 、相對(duì)溫度 （25±2）^°C，12h/12h 明暗交替、每小時(shí) 10～15 次通風(fēng)換氣的環(huán)境中，以普通顆粒飼料喂養(yǎng)，飲用水為純凈水。所有實(shí)驗(yàn)程序均經(jīng)四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)為P202303201）。

2 方法

2.1 藥液和墨汁的制備

（1）芍藥甘草湯：根據(jù)本課題組前期臨床研究，稱取生白芍 18g 生甘草 6g ，第一次煎煮前先將飲片用8倍體積RO純水浸泡 30min ，加熱回流收集藥液，第二次以6倍體積RO純水加熱回流再次收集藥液。合并2次藥液，冷卻后，用200目篩過濾，取濾液。濾液減壓濃縮成質(zhì)量濃度為 1.5g/mL 的濃縮液（以生藥量計(jì)），于 4^°C 冰箱保存?zhèn)溆茫褂们盎謴?fù)至室溫。（2）復(fù)方地芬諾酯溶液：將復(fù)方地芬諾酯片研磨成細(xì)粉，用生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為 1.5mg/mL 的混懸液，即配即用。3）墨汁：將阿拉伯膠 50g 與水 400mL 混合，煮沸至澄清透明，再加活性炭 25g ，混勻并煮沸3次，冷卻，用水定容至 500mL 4^°C 下保存，使用前放至常溫并攪拌搖勻。（4）乳果糖溶液：取乳果糖口服液適量，用生理鹽水制成質(zhì)量濃度為208.4mg/mL 的溶液，即配即用。（5）ASIC3抑制劑：取ASIC3抑制劑鹽酸阿米洛利適量，以生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為 2μg/mL 的阿米洛利溶液，避光，即配即用。

2.2 分組、造模與給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為空白組（12只）和造模組（48只），雌雄各半。造模組大鼠參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-]，采用復(fù)方地芬諾酯溶液灌胃 15mg/（kg?d） ，每天1次，連續(xù)14d構(gòu)建STC模型，空白組大鼠灌胃等體積生理鹽水。造模后，若造模組大鼠出現(xiàn)體形干癟瘦小、毛發(fā)豎立、拱背、活動(dòng)減少、糞便質(zhì)量減輕、糞便顆粒變細(xì)硬，大便Bristol評(píng)分較空白組顯著變化，且首粒黑便排出時(shí)間較空白組顯著延長(zhǎng)，則視為STC模型復(fù)制成功。造模后，大鼠全部存活。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、芍藥甘草湯組、乳果糖組（陽性對(duì)照）聯(lián)合抑制組，雌雄各半，每組12只。給藥劑量以兒童臨床用藥劑量為基礎(chǔ)，按人與大鼠等效劑量換算，給藥劑量參考課題組前期實(shí)驗(yàn)用量。芍藥甘草湯組、聯(lián)合抑制組大鼠灌胃芍藥甘草湯濃縮液（ 1.5g/mL ，乳果糖組大鼠灌胃乳果糖溶液（ 208.4mg/mL ），空白組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水;所有藥物均按大鼠體重以 0.01mL/g 灌胃。此外，聯(lián)合抑制組大鼠以配制好的阿米洛利溶液0 20μg/kg 腹腔注射，其他各組大鼠同步腹腔注射等體積生理鹽水。灌胃和腹腔注射均為每日1次，連續(xù)干預(yù)14d 。

2.3 腸道傳輸功能檢測(cè)

造模結(jié)束后大鼠立即禁食 24h ，然后以墨汁灌胃0 Δ?10mL/kg^′ ，記錄從灌胃結(jié)束到排出首粒帶活性炭糞便所需的時(shí)間，即為首粒黑便排出時(shí)間。上述指標(biāo)檢測(cè)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法每組選取4只大鼠禁食、不禁水24h ，以墨汁灌胃 （10mL/kg），30min 后予以戊巴比妥鈉1 30mg/kg） 腹腔注射麻醉，頸椎脫白處死，隨后立即置于手術(shù)臺(tái)上解剖，快速取出其全部腸道，在無張力的狀態(tài)下測(cè)量大鼠的腸道全長(zhǎng)及墨汁在腸道內(nèi)推進(jìn)的長(zhǎng)度，并計(jì)算腸道推進(jìn)率。腸道推進(jìn)率 （%）= 黑染腸道長(zhǎng)度/腸道全長(zhǎng) ×100%^[6] 。

2.4 內(nèi)臟敏感性檢測(cè)

使用自制的壓力球囊及自制的透明鼠籠進(jìn)行檢測(cè)。干預(yù)結(jié)束后，“2.3\"項(xiàng)下部分大鼠（ n=6 禁食 12h 后使用乙醚麻醉，將壓力球囊放入大鼠肛門內(nèi)約 5cm 處后固定，再將大鼠放人透明鼠籠。待大鼠蘇醒及適應(yīng)環(huán)境后，加壓球囊，分別在 20?40?60?80mmHg（1mmHg=） 133.322Pa 壓力下保持30s進(jìn)行腹壁撤退反射（abdomi-nalwithdrawalreflex，AWR）評(píng)分。AWR評(píng)分為0分：大鼠無明顯變化；1分：大鼠情緒不穩(wěn)定，身體靜正不動(dòng)，頭部偶爾扭動(dòng)或上下運(yùn)動(dòng)；2分：大鼠腹肌輕微回縮，但未離開鼠籠底面；3分：大鼠腹肌較強(qiáng)烈收縮，部分抬離鼠籠底面；4分：大鼠腹肌強(qiáng)烈收縮，腹部呈弓形，完全抬離鼠籠底面，骨盆抬起。記錄內(nèi)臟痛閾值（AWR評(píng)分 ?=3 時(shí)所對(duì)應(yīng)的壓力值）以反映內(nèi)臟敏感性，重復(fù)檢測(cè)3次，每次間隔 10min 。

2.5大鼠結(jié)腸組織中ASIC3的表達(dá)及分布觀察

采用免疫組化染色觀察。“2.4”項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取各組大鼠（ n=6 部分結(jié)腸組織（剩余部分置于 -80^°C 保存?zhèn)溆茫┯?4% 多聚甲醛固定，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、蒸餾水清洗、石蠟包埋、脫蠟并水化后，進(jìn)行切片；抗原修復(fù)切片，加入ASIC3抗體（稀釋比例為1：100）4^°C 孵育過夜，以PBS洗滌，滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（稀釋比例為1：100）孵育，再以PBS洗滌。將洗滌好的切片用DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，以中性樹膠封片。選取3個(gè)不同視野在顯微鏡下觀察，用數(shù)字掃描瀏覽軟件CaseViewer采集顯微圖像，用數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)計(jì)算圖像中ASIC3陽性（呈棕黃色）面積占比以反映ASIC3蛋白表達(dá)。

2.6大鼠結(jié)腸組織中ASIC3、ERK1、ERK2mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下部分于一 80^°C 保存的大鼠結(jié)腸組織 ，使用低溫研磨儀研磨，加人Trizol試劑提取結(jié)腸組織總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在cDNA（ 2μL ，以DEPC水稀釋至10ng/μL 中加入 0.2μmol/L 基因上下游引物、 10μL 的SYBRGreen試劑 ，7.8μL 的DEPC水，混勻后離心，再進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體程序?yàn)?95^°C，5min;94^°C，10s;60～ 66^°C，30s ；循環(huán)40次。以 β -actin為內(nèi)參，采用公式2^-ΔΔCt 計(jì)算各目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

表1PCR引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

2.7大鼠結(jié)腸組織中ASIC3、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)檢測(cè)

采用Westernblot法檢測(cè)。取“2.5”項(xiàng)下部分于-80^°C 保存的大鼠結(jié)腸組織（ n=6 ，加入RIPA裂解液浸沒組織并于低溫組織研磨儀中研磨。收集離心后的組織勻漿上清液，采用BCA法調(diào)整蛋白濃度 （2～3μg/μL） ！將蛋白變性后，進(jìn)行凝膠恒壓電泳、轉(zhuǎn)膜。洗去膜上殘留轉(zhuǎn)膜液，以 5%BSA 封閉1h，加人ASIC3、ERK1/2、p-ERK1/2一抗（稀釋比例均為1：1000）和 β -actin抗體（稀釋比例為 1：5 000 孵育過夜；TBST漂洗膜上未結(jié)合的一抗，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為 1：2 000 ），室溫孵育 ；TBST洗膜，滴加ECL顯影液于暗室中曝光顯影，采集蛋白條帶圖像。采用ImageJ軟件分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（ β -actin）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.8結(jié)腸ENS-Cajal間質(zhì)細(xì)胞-平滑肌細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)觀察

取“2.5”項(xiàng)下部分于 -80^°C 保存的大鼠結(jié)腸組織1 n=6 ），置于 2.5% 戊二醛固定液中固定過夜，以PBS漂洗；用 1% 四氧化 20^°C 固定 2h ，再以PBS漂洗樣本，完成后以梯度乙醇-丙酮脫水；脫水后包埋，于 37^°C 烘箱中過夜，再于 60^°C. 烘箱中聚合 48h 。樣本包埋塊以超薄切片機(jī)切片（ 60～90nm ，展開后撈至銅網(wǎng)，在室溫下先后以醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，室溫干燥過夜。采用透射電鏡觀察大鼠結(jié)腸組織超微結(jié)構(gòu)并采集圖像。每張銅網(wǎng)先于6000倍下觀察目標(biāo)區(qū)域整體結(jié)構(gòu)情況，再分別采集目標(biāo)區(qū)域下Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitialcellofCajal，ICC）（6000倍和30000倍）平滑肌細(xì)胞（smoothmusclecell，SMC）（6000倍和30000倍）、縫隙連接結(jié)構(gòu)（8000倍和40000倍）圖像。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料滿足正態(tài)分布以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);計(jì)量資料不符合正態(tài)分布以 M（P_²⁵，P_⁷⁵） 表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率 （%） 表示，采用 χ² 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05 。

3結(jié)果

3.1芍藥甘草湯對(duì)大鼠腸道傳輸功能的影響

與空白組比較，造模組大鼠排出首粒黑便時(shí)間顯著延長(zhǎng)[ （124.25±89.58）min Vs. （387.92±103.68）min，Plt; 0.01]，提示STC大鼠模型構(gòu)建成功。

空白組、模型組、乳果糖組、芍藥甘草湯組、聯(lián)合抑制組大鼠腸道推進(jìn)率分別為（ 80.22±8.30）% 、 63.86± 7.76）% 、 （65.64±9.72）% 、 76.29±10.03）% 、 （67.00± 9.28）% 。與空白組比較，模型組大鼠腸道推進(jìn)率顯著降低（ Plt;0.01 ；與模型組比較，芍藥甘草湯組大鼠腸道推進(jìn)率顯著升高 （Plt;0.01 ）。

3.2芍藥甘草湯對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響

空白組、模型組、乳果糖組、芍藥甘草湯組、聯(lián)合抑制組大鼠內(nèi)臟痛閾值分別為 （70.00±9.19 、 85.00±17.86） 一（ 67.78±5.44 、 48.33±5.05 ）、 68.89±9.11）mmHg 。與空白組比較，模型組大鼠內(nèi)臟痛閾值顯著升高 Plt; 0.05）；與模型組比較，乳果糖組和芍藥甘草湯組大鼠內(nèi)臟痛閾值均顯著降低 Plt;0.01 ）;與芍藥甘草湯組比較，聯(lián)合抑制組大鼠內(nèi)臟痛閾值顯著升高（ 1lt;0.05 ）。

3.3芍藥甘草湯對(duì)大鼠結(jié)腸組織中ASIC3蛋白表達(dá)的影響

空白組、模型組、乳果糖組、芍藥甘草湯組、聯(lián)合抑制組大鼠ASIC3陽性面積占比分別為 （20.41±5.91）% ！（6.71±4.82）H_o.（9.00±2.30）H_o.（16.23±5.10）H_o.（8.51± 4.27）% 。大鼠結(jié)腸組織中的ASIC3陽性表達(dá)呈棕黃色，主要表達(dá)在黏膜下層及肌層。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中ASIC3蛋白表達(dá)水平顯著降低（ Plt; 0.05）；與模型組比較，芍藥甘草湯組大鼠結(jié)腸組織中ASIC3蛋白表達(dá)水平顯著升高 （Plt;0.01 ；與芍藥甘草湯組比較，聯(lián)合抑制組大鼠結(jié)腸組織中ASIC3蛋白表達(dá)水平顯著降低（ Plt;0.01 ）。結(jié)果見圖1。

3.4芍藥甘草湯對(duì)大鼠結(jié)腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低 （Plt;0.05 或 Plt;0.01 ；與模型組比較，乳果糖組和芍藥甘草湯組大鼠結(jié)腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（ Plt;0.05） ；與芍藥甘草湯組比較，聯(lián)合抑制組大鼠結(jié)腸組織中ERK2、ASIC3mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（ Plt;0.05 或 Plt;0.01 ），ERK1mRNA相對(duì)表達(dá)量有下降趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ?Pgt;0.05 。結(jié)果見表2。

圖1各組大鼠結(jié)腸組織中ASIC3蛋白表達(dá)的免疫組化圖 ×400 ）

紅色箭頭：ASIC3陽性染色。

表2各組大鼠結(jié)腸組織中ERK1、ERK2、ASIC3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

a：與空白組比較， Plt;0.05：6 與空白組比較， Plt;0.01 ;c：與模型組 比較， Plt;0.05 ;d：與芍藥甘草湯組比較， Plt;0.01 ；e：與芍藥甘草湯組比 較， ΔPlt;0.05Δ □

3.5芍藥甘草湯對(duì)大鼠結(jié)腸組織中ERK1/2、p-ERK1/2及ASIC3蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中p-ERK1/2、ASIC3蛋白相對(duì)表達(dá)量以及p-ERK1/2與ERK1/2比值均顯著降低（ ΔPlt;0.05 或 Plt;0.01 ）;與模型組比較，乳果糖組和芍藥甘草湯組大鼠結(jié)腸組織中p-ERK1/2、ASIC3蛋白相對(duì)表達(dá)量以及p-ERK1/2與ERK1/2比值均顯著升高 （Plt;0.01） ;與芍藥甘草湯組比較，聯(lián)合抑制組大鼠結(jié)腸組織中ASIC3蛋白相對(duì)表達(dá)量以及 p -ERK1/2與ERK1/2比值均顯著降低（ ?Plt;0.05 或 Plt;0.01 ）。結(jié)果見表3及圖2。

3.6芍藥甘草湯對(duì)大鼠結(jié)腸ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)的影響

與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸ICC和平滑肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損：ICC呈梭形，ICC細(xì)胞核呈不規(guī)則形，可見核固縮現(xiàn)象，SMC細(xì)胞核呈不規(guī)則形，兩者均可

表3各組大鼠結(jié)腸組織中ERK1/2、p-ERK1/2、ASIC3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 ）

a：與空白組比較， Plt;0.01 ；b：與空白組比較， Plt;0.05：c; 與模型組比較， Plt;0.01 ;d：與芍藥甘草湯組比較， Plt;0.01 ;e：與芍藥甘草湯組比較 ?Plt;0.05， 0

圖2各組大鼠結(jié)腸組織中ERK1/2、p-ERK1/2、ASIC3蛋白表達(dá)的電泳圖

I：空白組；ⅡI：模型組；II：乳果糖組； IV ：芍藥甘草湯組；V：聯(lián)合抑制組。

見線粒體明顯腫脹，基質(zhì)溶解，線粒體嵴溶解，呈明顯空泡化樣變性；細(xì)胞間縫隙明顯增寬（空白組細(xì)胞間隙約為 0.05μm ，模型組細(xì)胞間隙約為 0.15μm ）。與模型組比較，芍藥甘草湯組大鼠結(jié)腸ICC和平滑肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯修復(fù)：ICC呈梭形，ICC細(xì)胞核呈橢圓形，SMC細(xì)胞核呈鋸齒狀，兩者細(xì)胞核染色質(zhì)均勻，線粒體輕度腫脹，基質(zhì)部分溶解，僅有少許空泡化樣變性；細(xì)胞間縫隙連接較為緊密（芍藥甘草湯組細(xì)胞間隙約為 0.07μm ）。與芍藥甘草湯組比較，聯(lián)合抑制組大鼠結(jié)腸ICC和平滑肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的修復(fù)作用明顯減弱：ICC呈星形，ICC細(xì)胞核皺縮，線粒體嵴溶解斷裂，基質(zhì)顆粒減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度或明顯擴(kuò)張，細(xì)胞膜不連續(xù)，SMC細(xì)胞核呈紡錘形，ICC細(xì)胞核呈類圓形，染色質(zhì)分布較均勻，核膜連續(xù)完整，細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹較明顯，嵴結(jié)構(gòu)減少，基質(zhì)稀淡，兩者線粒體均腫脹；細(xì)胞間縫隙連接較模型組更緊密而較芍藥甘草湯組稍松散（聯(lián)合抑制組細(xì)胞間隙約為0.10μm ）。結(jié)果見圖3。

4討論

STC是一類以結(jié)腸傳輸減慢為特點(diǎn)的頑固性便秘，其病理機(jī)制十分復(fù)雜，現(xiàn)代研究認(rèn)為與腸神經(jīng)系統(tǒng)、水液代謝、腸道動(dòng)力及腸道菌群等密切相關(guān)-2]。研究表明，中醫(yī)藥治療小兒STC療效明確，安全可靠，遠(yuǎn)期療效相對(duì)良好[3]。芍藥甘草湯是酸甘化陰的代表方劑，該方首載于《傷寒雜病論》，原方由白芍和甘草各4兩組成，后世醫(yī)家則提到該方臨床治療便秘療效顯著，適用于腸燥津虧便秘。《名醫(yī)別錄》指出白芍有通順血脈、利膀胱大小腸之效，《本經(jīng)疏證》也記載：“芍藥能入脾開結(jié)，芍藥合甘草以破腸胃之結(jié)。\"趙瓊教授恪守《素問·至真要大論》中“燥者濡之”的治療原則，結(jié)合長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)，提出以“酸甘化陰”為指導(dǎo)，酸甘相配、養(yǎng)陰增液、潤(rùn)腸通便，以芍藥甘草湯為基礎(chǔ)，在臨床上取得了良好的療效。本課題組前期臨床研究表明，以該方為基礎(chǔ)治療小兒STC效果顯著，同時(shí)也對(duì)本方重要的單體成分芍藥昔改善STC癥狀的效應(yīng)進(jìn)行了相關(guān)研究，證實(shí)了其有效性[4]。

注：圖中ICC的放大倍數(shù)為 ×30000 ;SMC的放大倍數(shù)為 ×8000 ；縫隙連接結(jié)構(gòu)的放大倍數(shù)為 ×40000. 0

圖3各組大鼠結(jié)腸組織ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)圖

ENS、ICC、SMC共同組成ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)，其被認(rèn)為是腸道動(dòng)力的基本單位，是完成排便功能的關(guān)鍵；ICC與腸神經(jīng)末梢呈突觸樣連接，與SMC呈縫隙連接，形成ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；ENS與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)胃腸道功能，同時(shí)，ENS具有完整的反射結(jié)構(gòu)，通過消化道神經(jīng)叢中的感覺、運(yùn)動(dòng)及中間神經(jīng)元調(diào)控腸內(nèi)感受、平滑肌運(yùn)動(dòng)及消化道內(nèi)外分泌等[9-10]。ICC是介于ENS和SMC之間的非神經(jīng)間質(zhì)細(xì)胞，在腸道內(nèi)廣泛分布，傳導(dǎo)慢波運(yùn)動(dòng)，將信號(hào)傳遞至SMC以此調(diào)控平滑肌運(yùn)動(dòng)。腸道平滑肌是腸道運(yùn)動(dòng)的效應(yīng)器，呈內(nèi)環(huán)外縱的雙層結(jié)構(gòu)，是腸道收縮和舒張功能正常的基礎(chǔ)，也是維持腸道完整性的重要組成部分。ENS與ICC之間及ICC與SMC之間分別通過突觸連接和縫隙連接互相傳遞信息，構(gòu)成了腸道運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ)單位。研究表明，便秘模型動(dòng)物中ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定平衡是維系腸道動(dòng)力正常的關(guān)鍵[]。STC患者及模型動(dòng)物中ICC多表現(xiàn)為數(shù)量減少或消失、體積縮小、分布不規(guī)則、超微結(jié)構(gòu)損傷[12]。SMC在STC患者和模型動(dòng)物中也被發(fā)現(xiàn)存在明顯異常，包括收縮力減弱、張力下降、厚度變薄、數(shù)量減少、形態(tài)異常、結(jié)構(gòu)破壞等[3]。Zhu等研究表明，芍藥甘草湯通過增加SMC和ICC數(shù)量，抑制ICC凋亡，激活干細(xì)胞因子/干細(xì)胞因子受體信號(hào)通路，從而保護(hù)ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)。總之，芍藥甘草湯通過影響ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)在STC的治療中起到重要作用，但其作用機(jī)制仍缺乏相對(duì)系統(tǒng)的研究。

ASICs是一類非電壓依賴性離子通道，其中ASIC3是ASICs家族在結(jié)腸中表達(dá)最多的亞型。已有研究提示，ASIC3可被酸性環(huán)境激活，介導(dǎo)酸感知和機(jī)械感知，對(duì)情緒、痛覺、酸味覺等具有重要作用，參與調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力、疼痛感知、血壓等[14-15]。研究證實(shí)，ASIC3在胃腸道黏膜也有表達(dá)，且可通過影響ENS從而促進(jìn)腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)，改善腸道動(dòng)力[。有研究報(bào)道，移植了便秘患兒糞便菌液的大鼠腸道組織中ASIC3表達(dá)顯著下調(diào)，內(nèi)臟敏感性降低，腸道推進(jìn)率下降，結(jié)腸傳輸時(shí)間延長(zhǎng)。Yuan等研究報(bào)道，ASIC3抑制劑能調(diào)節(jié)腸易激綜合征小鼠的腸道蠕動(dòng)并降低其內(nèi)臟敏感性。有研究報(bào)道，芍藥甘草湯或其主要成分可通過干預(yù)ASICs發(fā)揮鎮(zhèn)痛及修復(fù)損傷的作用，其中ERK信號(hào)通路可能是其干預(yù)的關(guān)鍵通路[19-20]。有研究顯示，在野生型小鼠的滑膜細(xì)胞中，酸性和炎癥條件均能激活A(yù)SIC3；單獨(dú)酸性條件下，p-ERK減少；酸性和炎癥條件共存時(shí)，p-ERK增加，抑制細(xì)胞增殖211，故ASIC3在不同條件下調(diào)控p-ERK的效果不同。另有研究表明，缺氧和ASIC3過表達(dá)可通過激活絲裂原活化蛋白激酶通路影響髓核細(xì)胞[20]。由此推測(cè)，芍藥甘草湯可能通過調(diào)控腸道ASIC3/ERK信號(hào)通路作用于ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)STC大鼠腸道動(dòng)力及內(nèi)臟敏感性，從而治療STC。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)芍藥甘草湯干預(yù)后，STC大鼠腸道推進(jìn)率顯著升高，內(nèi)臟敏感性顯著降低；實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，芍藥甘草湯的干預(yù)能顯著上調(diào)STC大鼠結(jié)腸組織中ERK1/2表達(dá)，促進(jìn)ASIC3、ERK1、ERK2mRNA和蛋白表達(dá)；透射電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)超微結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重：ICC呈梭形，細(xì)胞核不規(guī)則且可見核固縮，SMC細(xì)胞核也不規(guī)則，兩者線粒體明顯腫脹和空泡化，細(xì)胞間縫隙增寬，而經(jīng)芍藥甘草湯干預(yù)后，以上損傷可見明顯修復(fù)。ASIC3抑制劑的引人明顯抑制了芍藥甘草湯對(duì)STC大鼠以上機(jī)制的調(diào)控作用，表明芍藥甘草湯通過調(diào)控ASIC3信號(hào)通路改善了模型大鼠的便秘情況。

綜上所述，芍藥甘草湯可能通過調(diào)控ASIC3/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)ENS-ICC-SMC網(wǎng)絡(luò)來改善STC大鼠腸道動(dòng)力，降低內(nèi)臟敏感性，進(jìn)而發(fā)揮酸甘化陰、增液通便的效應(yīng)，其中ASIC3可能是芍藥甘草湯發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵因子。

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