負載鹽酸萬古霉素的聚多巴胺納米粒的制備及其聯合光熱的抗菌作用研究

中圖分類號R917；R943 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1887-06

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.12

Preparation of vancomycin hydrochloride-loaded polydopamine nanoparticles and their antimicrobial effect in combination with photothermal therapy

PAN Lihual，2，LIU Bin³ ， JIANG Xiayun2，ZHOU Xiaopeng2（1. School of Pharmacy， Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China；2.Dept.of Pharmacy，Lishui People’s Hospital，Zhejiang Lishui 323000，China;3.Dept.of Orthopaedics，Lishui Municipal Central Hospital，Zhejiang Lishui 3230o0，China）

ABSTRACTOBJECTIVE To prepare vancomycin hydrochloride（VH）-loaded polydopamine （PDA） nanoparticles （VH@PDA nanoparticles），andstudytheirantimicrobialeffectincombinationwithphotothermaltherapyMETHODSUsingPDAasthe carier，VH was loaded to prepare VH@PDAnanoparticles（PDA nanoparticles were preparedusing thesame method）.The nanoparticleswerecharacterizedwithlaserparticlesizeanalyzer，transmisionelectronmicroscope，andUVvisibleabsorption spectrometer；thedrugloadingcapacityandencapsulationeficiencyofthenanoparticlesweredetermined.Thenear-infraredlaser iradiationwasadoptedtodeterminetheirphototheralabilityakingStapylococcusureusasthreseachoject，thebactericidal propertiesofthenanparticlesincombinationwith photothermaltherapyinvitrowereclarifiedthroughplatecolonycoating method，live/deadstaininganalysis，crystalvioletstaining.UsingL929cellsastheresearchobject，theeffectsofVH@PDA nanoparticles at different mass concentrations（0，3.125，6.25，12.5，25，50 and 100μg/mL ）on cell viability were investigated to assesstheir biocompatibilityRESULTSVH@PDAnanoparticlesweresuccesfullyloadedwithVH，exhibitinguniformparticle size （approximately 300nm， ），distinct pore size，and a spherical structure. The drug loading capacity was 11.34% ，the encapsulation efficiency was 32.00% ，the photothermal conversion efficiency reached 23.55% ，and they demonstrated stable photothermalperformance.Theantibacterialefectresultsofthecombinedphotothermaltherapydemonstratedthatwithoutnear

infraredlaserirradiation，theantibacterialeffectsofVH，PDA nanoparticles，andVH@PDAnanoparticleswere not significant.However，when subjected to near-infrared laser irradiation，VH@PDA nanoparticles exhibited a pronounced antibacterial effect.Theresultsof the cell experimentsrevealed that after treatment with VH@PDA nanoparticles at various

mass concentrations，the cell viability rates remained above 80% .CONCLUSIONS VH@PDA nanoparticles are successfully prepared，whichexhibitstable phototheralproperties，significantantibacterialeffects whencombined withphotothermaltherap， and good biocompatibility.

KEYWORDsvancomycin；polydopamine；nanoparticles；photothermal therapy；antibacterial； biocompatibility

抗生素自被發現以來，就成為了治療細菌感染的主要藥物1。然而，抗生素的廣泛、持續使用也會導致耐藥細菌（如\"超級細菌\"）的出現2。研究顯示，超過 80% 的細菌可通過產生一種聚合物基質，使細菌附著于感染部位并形成一層高度耐藥的生物膜，從而阻止抗生素穿透，降低治療效果[]。

光熱治療（photothermaltherapy，PTT）作為一種非侵入性治療方式，具有可控性強、副作用小、抗菌譜廣、可避免細菌耐藥等優點，是抗菌治療的潛在替代方案。聚多巴胺（polydopamine，PDA）具有良好的生物相容性及自組裝特性，是理想的光熱材料，且具有潛在的光熱協同抗菌能力[4。然而，單獨的PTT需要使用較高的溫度，而高溫可能通過熱傳導效應導致周圍正常組織損傷，并且近紅外激光在穿透目標組織時強度會消減，導致其對深處細菌的抗菌能力減弱[。因此，臨床常將PTT與抗生素、氣體療法等結合使用，以實現協同治療，提高療效。

鹽酸萬古霉素（vancomycinhydrochloride，VH）對多種革蘭氏陽性菌具有抗菌活性，其可通過直接與細菌細胞壁中的肽聚糖結合、干擾肽聚糖前體的交叉聯結等方式，阻止細菌細胞壁形成三維空間結構，進而發揮抗菌作用；此外，VH還可通過損傷細菌細胞膜和抑制細菌RNA合成，發揮抗菌作用[6-。然而，VH具有一定的腎毒性、耳毒性，一般不推薦大劑量使用?；诖?，本研究擬以PDA為載體負載VH，制備VH@PDA納米粒，然后利用透射電子顯微鏡等手段對該納米粒進行表征，并考察該納米粒的光熱性能、生物相容性及其聯合光熱的抗菌活性，以期為臨床治療感染性疾病提供新的治療策略。

1材料

1.1 主要儀器

TecnaiG2F20型透射電子顯微鏡購自美國FEI公司；Litesizer500型激光粒度儀購自英國Malverm公司；VU4802型紫外-可見吸收光譜儀購自中國海特光電有限責任公司；VarioskanLUX型多功能酶標儀購自美國MolecularDevices公司;EVOSM500型倒置熒光顯微鏡購自美國ThermoFisherScientific公司等。

1.2 主要藥品與試劑

鹽酸多巴胺（批號D806618）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；甲氧基聚乙二醇-巰基、VH原料藥（純度大于 99% ）（批號分別為P824241、V105495）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；均三甲苯、氨水（批號分別為A21310、A112081）購自國藥集團化學試劑有限公司；泊洛沙姆F127（批號P2443）購自美國Sigma公司；盧里亞-貝爾塔尼瓊脂培養基（LB）（批號分別為L8290）購自上海吉至生化科技有限公司；活/死染色試劑盒及死細胞核染色試劑PI（批號CA1630）購自北京索萊寶科技有限公司；結晶紫（批號B46828）購自北京伊諾凱科技有限公司；DMEM培養基（批號C11330500BT）購自美國Gibco公司；胎牛血清（批號6021061）購自美國BI公司；青-鏈霉素溶液（批號15140-122）購自美國Hyclone公司；DAPI、CCK8試劑盒（批號分別為S2110、K1018）購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 細胞及細菌

小鼠成纖維細胞L929（CL-0137）購自武漢普諾賽生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（ATCC29213）由麗水市人民醫院感染科提供。

2 方法與結果

2.1 PDA納米粒的制備

將 0.1g 泊洛沙姆 _F127，0.15g 鹽酸多巴胺和 0.4mL 均三甲苯分散在 50% 乙醇中，超聲 2min 以形成乳液；在500r/min 攪拌條件下，將 0.15mL 氨水緩慢滴加到上述乳液中， 2h 后離心收集PDA顆粒，用水和乙醇分別洗滌3次，即得PDA納米粒。

2.2 VH@PDA納米粒的制備

將 200μL 甲氧基聚乙二醇-巰基水溶液 Δ5mg/mL ））和 200μL PDA納米粒溶液（ 15mg/mL ，臨用時用乙醇重懸）混合于 5mL 乙醇中，攪拌過夜；以 16000r/min 離心10min ，收集沉淀，即得PDA-聚乙二醇納米粒。將PDA-聚乙二醇納米粒重懸于 1mL 乙醇中，并在攪拌條件下緩慢滴加 1mLVH 水溶液 （0.1mg/mL ），再以 800r/min 攪拌過夜，離心、洗滌、凍干后，即得VH@PDA納米粒。

2.3 VH@PDA納米粒的表征

取 20μL VH@PDA納米粒溶液分散于純水中，采用激光粒度儀測量粒徑；將VH@PDA納米粒溶液滴在銅網上，室溫下干燥后，采用透射電子顯微鏡觀察該納米粒的形態特征;采用紫外-可見吸收光譜儀檢測VH、PDA納米粒、 .?VHQPDA 納米粒的特征吸收峰。結果顯示，VH@PDA納米粒的粒徑均一、孔徑明顯，呈現出直徑約為 300nm 的球形結構（圖1A、圖1B）；進一步分析發現，相比于PDA納米粒，VH@PDA納米粒在 281nm 波長處出現VH的吸收峰，表明該納米粒成功負載VH（圖1C）。

圖1 VH（aPDA 納米粒的表征結果

2.4 VH@PDA 納米粒的載藥量與包封率檢測

取VH原料藥溶于純水中，配制一系列不同質量濃度的VH對照品溶液，然后采用紫外-可見吸收光譜法建立VH的標準曲線9。取“2.2\"項下VH@PDA納米粒適量，以 12000r/min 離心 10min 后取上清液，根據標準曲線檢測上清液中游離VH的含量，然后計算VH@PDA納米粒的包封率及載藥量。其中，載藥量 （藥物總量一游離藥物含量）/（載體總量 + 藥物總量一游離藥物含量） ×100% ，包封率 （藥物總量一游離藥物含量）藥物總量 ×100% 。結果顯示，VH的線性方程為 ′=0.003 7x+ 0.0007（ r=0.9991 ）； ΔVH@PDA 納米粒的載藥量為11.34% ，包封率為 32.00% 。

2.5VH@PDA納米粒的光熱性能考察

取 VH（OPDA 納米粒適量，以純水稀釋成不同質量濃度 （0，37.5，75，150，300μg/mL 的 ΔVH@PDA 納米粒溶液；用 808nm 近紅外激光 （1W/cm² 照射純水和上述不同質量濃度 ΔVH@PDA 納米粒溶液 300s ，記錄溫度變化；再用不同功率 （2，1.5，1W/cm²） 的 808nm 近紅外激光照射 300μg/mL 的 ΔVH@PDA 納米粒溶液 300s ，記錄溫度變化。取上述 300μg/mL VH@PDA納米粒溶液適量，用 808nm 近紅外激光（ 1W/cm²， 照射300s后關閉光源令其自然降溫冷卻，記錄降溫過程中溫度隨時間的變化，然后根據相關公式繪制光熱轉化效率擬合圖，并計算光熱轉化效率；以上相同過程重復升溫、降溫3次，繪制開關實驗溫度變化曲線，以驗證該納米粒的光熱穩定性。結果顯示，經 808nm 近紅外激光照射300s后，37.5，75，150，300μg/mL 的 ΔVH@PDA 納米粒溶液溫度分別為 36.3，49.0，61.1，68.4^°C （圖2A）； 300μg/mL 的VH@PDA納米粒溶液隨著近紅外激光功率的增加，溫度也逐漸增加，300s后溫度可達 45^°C （此溫度下可破壞細菌細胞壁結構[1）以上（圖2B）;根據圖2C并通過相關公式計算出 ΔVH@PDA 的光熱轉化效率為 23.55% ；由開關實驗溫度變化曲線（圖2D）可知，VH@PDA納米粒的光熱性能穩定。

圖2 VH（aPDA 納米粒的光熱性能考察結果

2.6VH@PDA納米粒聯合光熱的體外抗菌作用

2.6.1 瓊脂平板法考察

取對數生長期（ OD₆₀₀=0.5 的金黃色葡萄球菌，用磷酸鹽緩沖液調整其濃度為 。將上述菌液分為空白組（水）、PDA納米粒組 2.27μg/mL ）、VH組（ 0.28μg/mL ） Δ.VH@PDA 納米粒組 （0.28μg/mL ，以VH計），加入相應藥液/水（各組給藥劑量根據預實驗結果設置），以近紅外激光（功率 2W/cm² ，波長 808nm ；下同）照射 300s 后取 50μL 菌液涂布在瓊脂平板上， 37^°C 過夜培養后觀察菌落數；同樣按上述方法分組、給藥，但不進行近紅外激光照射，將菌液直接涂布到LB瓊脂平板上過夜培養，觀察菌落數。結果（圖3）顯示，當不以近紅外激光照射處理時，各組抗菌效果不明顯；而以近紅外激光照射處理時，PDA納米粒組和VH@PDA納米粒組均表現出抗菌效果，但VH@PDA納米粒組的菌落數明顯減少，表明其抗菌作用更強。

圖3瓊脂平板法考察結果

2.6.2活/死細菌染色法考察

將金黃色葡萄球菌按\"2.6.1\"項下方法分組、給藥，以近紅外激光照射300s后，以 5000r/min 離心 5min ，取沉淀；經生理鹽水洗滌3次后，用 500μL 生理鹽水重懸，加人 1.5μL 混合染料（DAPI與PI以1：1混合），每隔5min振蕩混勻，于室溫下避光培養 30min ；取 5μL 滴在載玻片上，蓋上蓋玻片靜置 10min 后，使用倒置熒光顯微鏡觀察，統計死細菌和活細菌的熒光強度（死細菌被染成紅色），并計算死細菌比例（死細菌比例 死細菌數/細菌總數 ×100% ）。每組重復3次。采用GraphPadPrism9.5.1軟件進行統計學分析，數據以 表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準 α=0.05 。結果（圖4）顯示，與空白組 （5.29±1.27）% 相比，PDA納米粒組、VH組和VH@PDA納米粒組死細菌比例[分別為（ （17.90± 6.53% 一 （24.86±6.13）% 和 （57.93±0.64）%] 均顯著升高中 （Plt;0.05） ；與PDA納米粒組、VH組相比，VH@PDA納米粒組死細菌比例顯著升高 ?Plt;0.05 D。

2.6.3結晶紫染色法考察

將金黃色葡萄球菌按“2.6.1”項下方法調整濃度后，加入96孔板中，再按“2.6.1\"項下方法分組、給藥，每組設3個復孔，以近紅外激光照射300s后，于 37^°C 條件下培養 48h ；待孔板中形成生物膜后用磷酸鹽緩沖液洗滌，以去除游離菌；加入甲醇固定并自然風干后，每孔加入1% 結晶紫溶液染色 15min ；洗凈多余的結晶紫并置于37^°C 烤箱中烘干，采用倒置熒光顯微鏡觀察生物膜形態結構（紫色越深表明細菌生物膜越完整，藥物抑制作用越?。蛔仙綔\則表明藥物抑制作用越強[12。結果（圖

5）顯示，與空白組相比，PDA納米粒組、VH組、VH@PDA納米粒組金黃色葡萄球菌的生物膜形態均被破壞;其中VH@PDA納米粒組的破壞作用最明顯，與瓊脂平板法、活/死細菌染色法考察結果相一致。

2.7VH@PDA納米粒的生物相容性考察

將L929細胞按 1×10⁴ 個/孔接種于96孔板中，分為不同質量濃度 （0，3.125，6.25，12.5，25，50，100μg/mL 以VH@PDA納米粒計）VH@PDA納米粒組，每組設置3個復孔；孵育 24h 后，采用CCK8檢測試劑盒測定各組細胞活力。結果（圖6）顯示，隨著VH@PDA納米粒質量濃度的增加，L929細胞存活率雖略有下降，但均高于80% ，表明VH@PDA納米粒具有較好的生物相容性。

3 討論

目前，治療細菌感染最大的挑戰是細菌耐藥，因此，為了避免細菌耐藥及提高療效，臨床上常使用多種藥物聯合治療細菌感染[13]；除此之外，相關研究也報道了抗生素聯合其他方法治療細菌感染，如活性納米載體聯合抗生素、PTT聯合抗生素等治療策略[14]

PTT作為一種新興的非抗生素抗菌療法，其利用高光熱轉化效率的材料在近紅外激光誘導下將光能轉化為熱能，通過產生局部高溫而破壞細菌細胞壁以達到抗菌效果[15]。PDA作為黑色素之一，其吸收波長從紫外光到可見光并一直延伸至近紅外區域，相關研究發現，PDA納米粒的光熱轉化效率高達 40% ，已超過公認的金納米棒的轉化效率[]。Liu等通過合成 Fe₃O₄@PDA 納米粒，再負載熱休克蛋白70抑制劑2-苯乙炔磺酰胺，形成新型協同抗菌納米復合物；將該納米復合物置于近紅外激光下照射，可釋放2-苯乙炔磺酰胺，并特異性干擾熱休克蛋白70，較單用FeO4@PDA納米粒提高了抗菌效果。Yu等利用 Fe₃O₄@. PDA納米粒作為核心結構連接第3代樹突狀聚酰胺-胺型高分子PAMAM，制備出Fe3O4@PDA@PMAA @ PAMAM納米復合物；將該納米復合物置于近紅外激光下照射，可實現一氧化氮的控制釋放，從而明顯降低細菌活性。由此可知，利用PDA為載體制備具有光熱性能的納米粒具有一定開發前景。

圖4活/死細菌染色法考察結果

圖5結晶紫染色法考察結果

VH由于其耳、腎毒性等不良反應發生率較高，通常不推薦大劑量使用，且僅適用于耐藥革蘭氏陽性菌所致嚴重感染。本研究通過制備VH@PDA納米粒，以實現減少VH劑量并提高抗菌效果的目的。結果顯示，VH@PDA納米粒實現了VH的高效負載，且粒徑分布均一；在近紅外激光照射下，該納米?？捎行茐纳锬ば螒B，抗菌效果比非近紅外激光照射效果更好，且具有良好的生物相容性。相比于VH原料藥，該納米粒對金黃色葡萄球菌的抑制作用更強，展現出優異的光熱協同抗菌性能。

圖6 VH（aPDA 納米粒的生物相容性考察結果（ n=3 ）

綜上所述，VH@PDA納米粒具有穩定的光熱性能，聯合光熱的抗菌作用明顯，且具有良好的生物相容性。后續本課題組將完善該納米粒的體內研究，為臨床治療感染性疾病提供可靠策略。

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