益肺宣肺降濁方通過抑制線粒體分裂抗血管性癡呆的作用研究

中圖分類號R965 文獻標志碼A 文章編號 1001-0408（2025）15-1859-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2025.15.07

∈鍵詞血管性癡呆;益肺宣肺降濁方;線粒體分裂;HSP90/MLKL/Drpl信號通路

Anti-vascular dementia effect of Yifei xuanfei jiangzhuo formula by inhibiting mitochondrial fission

FU Yulan'，CHEN Wei2， ZHUO Guifeng'，ZHU Xiaomin1，HUANG Yingrui’，ZHANG Jinzhi1，YANG Fucai'， ZHANG Ying1，WU Lin³ （1.The First Clinical Collge，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530022，China;2.Dept.of Encephalopathy，Zone 1，the First Afliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530022，China;3.Graduate School，Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530200，China）

ABSTRACTOBJECTIVEToinvestigatetheinterventioneffectanditspotentialmechanismofYifei xuanfeijangzhuofomula byinhibiting mitochondrialfisioninavasculardementia（VaD）modelrats.METHODsVaDrat modelwas established by bilateralcommoncarotidarteryligation.Theexperimentalanimalswererandomlydividedintoshamoperationgroup（SHAM）， modelgroup（MOD），Yifeixuanfeijiangzhuoformulalow-dose group（YFXF-L），Yifeixuanfei jiangzhuoformulahigh-dosegroup （YFXF-H），andDonepezilhydrochloride group（positivecontrol），with9animals ineach group.After30daysof intervention， thespatiallearning memoryabilitywasassessedbyMorrswatermazeexperiment；HEstaining wasusedtoobserve histopathologicalchangesin CAlareaof hippocampus；ELISAwasused todetectthelevelsofserum inflammatoryfactors [interleukin-1β（IL-1β）andIL-4]；Westernblotwasused todetecttheexpresionsofheatshockprotein90（HSP90）/mixed lineagekinasedomain-likeprotein（MLKL）/dynamin-relatedprotein1（Drpl）pathway-relatedproteins，mitochondrialfusion

proteins （MFN1， MFN2）， and adenosine triphosphate synthase5A（ATP5A）inhippocampaltissues.The immunohistochemistry wasused to detect the levelof phosphorylated MLKL （p-MLKL）；real-time fluorescence quantitative PCR was adoptedto detect mRNA expressionsof HSP90，MFN1，MFN2 and ATP5A.RESULTSCompared with SHAM group，the escape latency of rats in the MOD

groupwas significantlyprolonged，thenumberofcrosing theplatformwassignificantlyreduced，andthe hippocampal tisues showedtypical neuronaldamagecharacteristics，thepositiveexpresionlevelofp-MLKLandtheserumlevelofIL-1βsignificantly increased，whiletheserumlevelofIL-4significantlydecreased，theproteinandmRNAexpresionofHSP9O，aswellasthe protein expresiosofp-MKL/MLKLandp-Drpl（Ser616）/Drplwereallsignificantlyincreasedinippocampal tisue，theprotein and mRNA expresions of MFN1，MFN2 and ATP5A，and protein expressionof p-Drp1（Ser637）/Drpl were all significantly decreased （ .Plt;0.05 ）.After the intervention of Yifei xuanfei jiangzhuo formula，above indicators in each treatment group were all significantly reversed Plt;0.05 ）.CONCLUSIONs Yifei xuanfei jiangzhuo formula may alleviate neuronal damage and neuroinflammatoryresponses in VaDratsbyregulatingtheHSP90/MLKL/Drplsignalingpathwayinibitingmitochondrialfion， thereby maintaining mitochondrial dynamic balance and improving mitochondrial function.

KEYWORDSvasculardementia;Yifei xuanfeijiangzhuo formula；mitochondrial fision；HSP90/MLKL/Drplsignaling pathway

血管性癡呆（vasculardementia，VaD）是由腦血管疾病引發(fā)的認知功能障礙綜合征，以認知缺陷、定向力障礙、日常生活能力下降及血管損傷為主要特征。2020年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國60歲及以上人群中有1507萬癡呆癥患者，其中VaD患者約392萬[2。VaD的病理機制涉及神經(jīng)炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙及神經(jīng)元損傷等多種因素，其中線粒體動力學是當前研究的熱點。

線粒體動力學，即線粒體融合與分裂的動態(tài)平衡，對維持線粒體功能至關(guān)重要，其異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[。磷酸甘油酸變位酶5（phos-phoglyceratemutase5，PGAM5）是一種線粒體膜蛋白磷酸酶，參與線粒體分裂、細胞死亡及代謝調(diào)控4。動力相關(guān)蛋白1（dynamin-relatedprotein1，Drp1）是線粒體分裂的主要調(diào)節(jié)因子，其過度激活導致線粒體過度分裂，引發(fā)細胞凋亡。可見，PGAM5/Drp1信號通路可能參與調(diào)控線粒體動力學系統(tǒng)，但其上游機制尚不明確。熱休克蛋白90（heatshockprotein90，HSP90）是一種三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）依賴的分子伴侶，參與蛋白折疊、細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持及信號轉(zhuǎn)導等過程。研究表明，在應激條件下，HSP90的分泌會增加，從而促進活性氧和活性氮釋放，加劇炎癥反應。混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL）是壞死性凋亡中的關(guān)鍵效應分子，其激活依賴HSP90的調(diào)控。HSP90與MLKL的結(jié)合對維持MLKL的穩(wěn)定性至關(guān)重要，抑制HSP90可降低MLKL磷酸化水平，減少其寡聚化和質(zhì)膜易位，從而抑制壞死性凋亡和炎癥反應。研究表明，MLKL與PGAM5形成的分子級聯(lián)反應可招募Drp1至線粒體，促進其易位并通過去磷酸化激活Drp1的鳥苷三磷酸酶活性，最終導致線粒體斷裂和細胞壞死[8-9]。因此，HSP90/MLKL可能為PGAM5/Drp1信號通路的潛在上游，抑制HSP90/MLKL/Drp1信號通路可能對調(diào)控線粒體分裂、改善線粒體動力學具有重要意義。

益肺宣肺降濁方由黃芪、人參、麥冬、三七、蘇子、石菖蒲、桔梗、苦杏仁、酒大黃9味中藥組成。方中人參、黃芪相須為用，補益肺氣以充養(yǎng)五臟；麥冬、桔梗、苦杏仁、蘇子宣通肺氣，消痰降濁；石菖蒲化濕豁痰益智，三七活血化癖，酒大黃通腑降濁。諸藥相合，既可益肺宣肺補本，又能通絡祛痰、通腑降濁除標。該方主要活性成分包括人參皂苷等[0]。研究表明，人參皂苷能夠通過抑制HSP90的釋放降低血腦屏障通透性并減輕神經(jīng)炎癥[]。本課題組前期研究表明，益肺宣肺降濁方能夠提高VaD大鼠海馬組織中線粒體復合物活性及ATP含量，同時降低炎癥因子水平[12-13]，但其具體作用機制仍有待闡明。本研究主要探討益肺宣肺降濁方通過調(diào)控HSP90/MLKL/Drp1信號通路對線粒體動力學的干預機制，以期為VaD的中醫(yī)治療提供理論依據(jù)。

1材料

1.1主要儀器

本研究所用主要儀器包括XR-XM101型Morris水迷宮儀器（上海欣軟信息科技有限公司），CFX96型實時熒光定量PCR（qPCR）儀（美國Bio-Rad公司），BX43型光學顯微鏡、UC90型顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus公司），DYY-4C型電泳儀、DYY-12型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）。

1.2主要藥品與試劑

益肺宣肺降濁方（飲片組成：黃芪 15g ，人參 15g ，麥冬 15g ，桔梗 10g ，苦杏仁 10g ，三七 15g ，蘇子 15g ，石菖蒲 15g ，酒大黃 6g 由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，經(jīng)該院藥學部主任中藥師田元春鑒定均為真品。鹽酸多奈哌齊片（國藥準字H20050978，規(guī)格 5mg/ 片，批號2203026）購自衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司；蘇木精（批號BA-4041）伊紅（批號BA-4024）染色劑均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；RIPA組織裂解液（貨號R0020）購自北京索萊寶科技有限公司；Trizol、氯仿、異丙醇及無水乙醇均購自天津市永大化學試劑有限公司；白細胞介素1β（interleukin- ?1β ，IL-1β）（貨號MM-0047R1）和IL-4（貨號MM-0191R1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；HSP90抗體（貨號#4877，兔抗）購自美國CST公司；MLKL抗體（批號A21894，兔抗）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；磷酸化（phosphorylated，p）-MLKL抗體（貨號ET1705-51，兔抗）購自杭州華安生物技術(shù)有限公司;Drp1抗體（貨號12957-1-AP，兔抗）、ATP合成酶5A（ATPsynthase5A，ATP5A）抗體（貨號66037-1-lg，兔抗）線粒體融合蛋白（mitochondrial fusionprotein，MFN）1抗體（貨號66776-1-Ig，鼠抗）、MFN2抗體（貨號67487-1-Ig，鼠抗）、GAPDH抗體（貨號60004-1-Ig，鼠抗）以及辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（貨號SA00001-2）和山羊抗鼠二抗（貨號SA00001-1）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；p-Drp1抗體（磷酸化位點Ser637，貨號BD-PP0841，兔抗）、p-Drp1抗體（磷酸化位點Ser616，貨號BD-PP1318，兔抗）均購自蘇州博奧龍科技有限公司;qPCR試劑盒（貨號Q712）、RNA提取試劑（貨號R701-01）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號R123-01）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。實驗所需PCR引物均由南寧捷尼斯生物科技有限公司完成設計與合成。

1.3實驗動物

SPF級SD雄性大鼠45只，7周齡，體重 （280±20）g 由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004]。所有大鼠均飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境中（使用許可證號為SYXK桂2024-0004），在恒溫 （24±1）^°C，12h 光/暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)。實驗方案經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會審批通過（倫理批號DW20220212-062-08），所有操作均嚴格遵循實驗動物福利倫理規(guī)范。

2 方法

2.1 藥液的制備

中藥藥液：稱取黃芪、人參、麥冬、三七、蘇子、石菖蒲各 15g ，桔梗、苦杏仁各 10g ，酒大黃 6g ，置于燒瓶中，加水 2000mL ，煎煮 2h×3 次；過濾，合并3次濾液，于45^°C 水浴中減壓濃縮至 1.218g/mL （以生藥量計），于4^°C 下保存?zhèn)溆谩ｊ栃詫φ杖芤海喝←}酸多奈哌齊片，研磨，溶于 110mL 蒸餾水中，制成質(zhì)量濃度為 0.045mg/mL 的陽性對照溶液。

2.2 造模、分組與給藥

采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法建立VaD大鼠模型。將大鼠隨機分為假手術(shù)組（SHAM組， n=9 和手術(shù)組 n= 36）。手術(shù)組大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，行頸部正中切口，分離并結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈進行造模；SHAM組大鼠僅進行血管分離操作。造模后第3天，進行Morris水迷宮行為學測評，以SHAM組大鼠逃避潛伏期為參考值，計算兩組大鼠逃避潛伏期的差值與參考值之比，若該比值 gt; 20% ，則評定VaD模型構(gòu)建成功[14]。將造模成功的大鼠隨機分為模型組（MOD組）益肺宣肺降濁方低劑量組[YFXF-L組，給藥劑量為 12.18g/（kg?d） 小、益肺宣肺降濁方高劑量組[YFXF-H組，給藥劑量為 24.36g/（kg?d）] 鹽酸多奈哌齊組[DH組，給藥劑量為 0.2g/（kg?d） ，陽性對照]，每組9只。藥物持續(xù)干預 30d ，其中MOD組和SHAM組大鼠給予等體積生理鹽水[ 10mL/（kg?d）] 。給藥劑量依據(jù) 60kg 成人的臨床等效劑量換算確定。

2.3 Morris水迷宮實驗

藥物干預結(jié)束后，運用Morris水迷宮實驗評估所有大鼠的學習及空間記憶能力。每只大鼠連續(xù)進行5dMorris水迷宮實驗。將水迷宮劃分為4個象限，平臺置于第2象限，注水沒過平臺約 3cm 。前4d進行定位航行實驗，分別將大鼠從4個象限放人，大鼠找到平臺則停正實驗，記錄大鼠的逃避潛伏期；若大鼠 60s 內(nèi)未找到平臺，則引導它們至平臺并停留 1min 后取出。實驗第5天實施空間探索測試，采集第5天的實驗數(shù)據(jù)，移除平臺后記錄各組大鼠60s內(nèi)穿越平臺次數(shù)。

2.4 標本制備

Morris水迷宮實驗測試完成后，大鼠經(jīng) 20% 烏拉坦麻醉后，腹主動脈取血，以 3000r/min 離心 15min ，取上清液，于 -80^°C 儲存，備用。取血后處死大鼠。隨機選取各組6只大鼠，分離其大腦海馬組織，置于 -80^°C 超低溫冰箱中保存，用于Westernblot及qPCR檢測。另取各組3只大鼠，經(jīng)心臟灌注固定后取海馬組織，用 4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，保存于 4°C ，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化分析。

2.5大腦海馬CA1區(qū)組織病理學觀察

采用HE染色。取“2.4\"項下制備的石蠟組織塊，切片 5μm） ，切片于蘇木精-伊紅染液染 3min ，用自來水洗滌，分化液分化10s，再用自來水洗滌。經(jīng)無水乙醇水化、二甲苯脫蠟、中性樹膠封片后，于光學顯微鏡下觀察并采集大腦海馬CA1區(qū)組織病理學圖像。

2.6海馬組織中p-MLKL表達檢測

采用免疫組化法檢測。取“2.5”項下大鼠腦組織切片，經(jīng)烘干、二甲苯脫蠟、乙醇洗脫、抗原修復、封閉后，加入p-MLKL一抗（稀釋比例為1：50）及對應二抗孵育。顯影階段采用DAB顯色試劑避光反應，蘇木精復染細胞核，經(jīng)氨水返藍處理后用中性樹膠封固，最后通過數(shù)字病理掃描系統(tǒng)采集圖像，觀察DAB顯色強度并定量分析。

2.7海馬組織中HSP90/MLKL/Drp1信號通路相關(guān)蛋 白表達的檢測

采用Westernblot法檢測。取“2.4\"項下各組大鼠凍存的大腦海馬組織，經(jīng)低溫勻漿后，采用RIPA裂解液提取蛋白，離心，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度并進行加熱變性處理。取變性蛋白 10μg 進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并在室溫下用 5% 脫脂牛奶封閉 2h ;加入相應一抗[稀釋比例依次為抗GAPDH1：7000，抗HSP901：1000、抗p-MLKL 1：1 000 ，抗MLKL 1：500 ，抗p-Drp1（Ser637）1：500 ，抗p-Drp1（Ser616） 1：500 ，抗Drp1 1：2 000 ，抗ATP5A1：5000，抗MFN11：4000，抗MFN21：6000]，于 4^°C！ 孵育過夜；加入相應二抗（稀釋比例均為1：7000），室溫孵育2h；經(jīng)TBST緩沖液洗滌后，采用化學發(fā)光法顯影后進行蛋白條帶成像，并通過ImageJ軟件對條帶灰度值進行定量分析。以HSP90、ATP5A、MFN1、MFN2與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶灰度值的比值表示目標蛋白的表達水平，以p-MLKL與MLKL、p-Drp1（Ser637）與Drp1、p-Drp1（Ser616）與Drp1條帶灰度值的比值表示MLKL、Drp1（Ser637）、Drp1（Ser616）蛋白的磷酸化水平。

2.8海馬組織中HSP90、MFN1、MFN2、ATP5AmRNA表達的檢測

采用qPCR法檢測。取“2.4\"項下各組大鼠凍存的海馬組織適量，以Trizol通用試劑裂解，以異丙醇沉淀氯仿，加入 75% 乙醇純化得到總RNA，分析純度與濃度后，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行PCR擴增。PCR體系包括：cDNA模板 1μL ，SYBR Green Master Mix 5μL ，正、反向引物各 0.4μL ，加無核酸酶水至 20μL 0PCR擴增條件如下： 95^°C 預變性 變性 10s 60^°C 退火/延伸 30s ，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用 2^-ΔΔCt 法計算目標基因mRNA的相對表達量，結(jié)果以SHAM組為參照進行歸一化處理。PCR引物序列及產(chǎn)物長度見表1。

表1PCR引物序列及產(chǎn)物長度

2.9 血清中炎癥因子水平檢測

取“2.4”項下血清樣品，室溫融化，按照ELISA試劑盒說明書操作，采用酶標儀檢測血清中IL-1β、IL-4水平。

2.10 統(tǒng)計學方法

采用SPSS25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以 表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05 。

3結(jié)果

3.1益肺宣肺降濁方對VaD大鼠學習及空間記憶能力的影響

與SHAM組比較，MOD組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)顯著減少 Plt;0.05） ；與MOD組比較，各給藥組大鼠逃避潛伏期均顯著縮短，穿越平臺次數(shù)均顯著增加（ ?Plt;0.05 ）。結(jié)果見表2。

表2各組大鼠逃潛伏期及穿越平臺次數(shù)比較 n=9 ）

a：與SHAM組比較， Plt;0.05：6 ：與MOD組比較， .Plt;0.05 。

3.2益肺宣肺降濁方對VaD大鼠海馬CA1區(qū)組織病理學變化的影響

SHAM組大鼠海馬結(jié)構(gòu)整齊，CA1區(qū)錐體細胞層排列規(guī)整，細胞核形態(tài)正常。與SHAM組比較，MOD組大鼠海馬組織損傷明顯，CA1區(qū)錐體細胞結(jié)構(gòu)排列紊亂，細胞大量壞死，染色不均，細胞間隙較大；大量神經(jīng)元凋亡、固縮、深染。與MOD組比較，各給藥組大鼠海馬組織損傷均有改善，且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其中YFXF-L組大鼠海馬CA1區(qū)組織損傷程度較MOD組有所改善，表現(xiàn)為細胞間隙縮小，但仍可見大量神經(jīng)元固縮、深染，部分錐體細胞排列相對整齊，細胞核形態(tài)正常，染色均勻；YFXF-H組和DH組大鼠海馬組織損傷明顯減輕，CA1區(qū)錐體細胞排列較為整齊，細胞核形態(tài)完整，僅見少量神經(jīng)元固縮、深染，且兩組改善效果相當。結(jié)果見圖1。

3.3益肺宣肺降濁方對VaD大鼠海馬組織中p-MLKL陽性表達量的影響

與 SHAM組比較，MOD組大鼠海馬組織中p-MLKL的陽性表達量顯著升高（ Plt;0.05） ；與MOD組比較，各給藥組大鼠海馬組織中p-MLKL的陽性表達量均顯著降低 ?Plt;0.05 0。結(jié)果見圖2、表3。

圖1各組大鼠海馬CA1區(qū)組織HE染色顯微圖（ ×400 ）

圖2各組大鼠海馬組織中 p -MLKL陽性表達免疫組化顯微圖（ ×400 ））

表3各組大鼠海馬組織中 -MLKL陽性表達量和血清中IL-1β、IL-4水平比較 （2

a：與SHAM組比較， Plt;0.05 ；b：與MOD組比較 .Plt;0.05

3.4益肺宣肺降濁方對 VaD 大鼠血清中IL-1β、IL-4水平的影響

與SHAM組比較，MOD組大鼠血清中IL-1β水平顯著升高，IL-4水平顯著降低（ ?Plt;0.05 ）；與MOD組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β水平均顯著降低，IL-4水平均顯著升高（ Plt;0.05 ）。結(jié)果見表3。

3.5益肺宣肺降濁方對VaD大鼠海馬組織中HSP90/ MLKL/Drp1信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與SHAM組比較，MOD組大鼠海馬組織中HSP90、p-MLKL/MLKL、p-Drp1（Ser616）/Drp1蛋白表達水平均顯著升高（ （Plt;0.05） ，p-Drp1（Ser637）/Drp1、MFN1、MFN2、ATP5A蛋白表達水平均顯著降低（ Plt;0.05 ；與MOD組比較，各給藥組大鼠海馬組織中HSP90、p-MLKL/MLKL、p-Drp1（Ser616）/Drp1蛋白表達水平均顯著降低 （Plt;0.05） ），p-Drp1（Ser637）/Drp1、MFN1、MFN2、ATP5A蛋白表達水平均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見圖3、表4。

3.6益肺宣肺降濁方對大鼠海馬組織中HSP90、MFN1、MFN2、ATP5AmRNA表達的影響

與SHAM組比較，MOD組大鼠海馬組織中HSP90mRNA表達水平顯著升高（ （Plt;0.05） ，MFN1、MFN2、

圖3各組大鼠海馬組織中HSP90/MLKL/Drp1信號通路相關(guān)蛋白表達電泳圖

I：SHAM組;II：MOD組;II：YFXF-L組; N ：YFXF-H組; ΔV ·DH組。

表4各組大鼠海馬組織中HSP90/MLKL/Drp1信號通路相關(guān)蛋白表達水平比較 ）

a：與SHAM組比較 Plt;0.05 ；b：與MOD組比較， Plt;0.05_lt;

ATP5AmRNA表達水平均顯著降低 ?lt;0.05 ）；與MOD組比較，各給藥組大鼠海馬組織中HSP90mRNA表達水平均顯著降低 （Plt;0.05） ，MFN1、MFN2、ATP5AmRNA表達水平均顯著升高 （Plt;0.05 ）。結(jié)果見表5。

表5各組大鼠海馬組織中HSP90、MFN1、MFN2、ATP5AmRNA表達水平比較 0

a：與SHAM組比較 ?Plt;0.05 ;b：與MOD組比較， ?Plt;0.05 。

4討論

研究表明，VaD的病理機制與腦組織持續(xù)性低灌注導致的代謝紊亂密切相關(guān)。線粒體在神經(jīng)炎癥調(diào)控中起關(guān)鍵作用，膠質(zhì)細胞活化釋放的炎癥因子又加劇線粒體氧化應激，促進線粒體DNA釋放并激活炎癥小體[15]。上述病理過程相互促進，共同推動VaD的發(fā)生發(fā)展。

本課題組前期研究表明，益肺宣肺降濁方通過改善海馬神經(jīng)元損傷、減輕神經(jīng)炎癥，進而發(fā)揮改善VaD的作用[4]。本研究行為學實驗結(jié)果顯示，與SHAM組比較，MOD組大鼠逃避潛伏期顯著延長，穿越平臺次數(shù)顯著減少，而益肺宣肺降濁方干預后上述指標顯著改善，提示其可改善VaD大鼠的學習及空間記憶功能。組織病理學結(jié)果顯示，MOD組大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂，細胞間隙增寬，核固縮明顯；益肺宣肺降濁方干預后細胞損傷減輕，結(jié)構(gòu)趨于致密。ELISA結(jié)果顯示，MOD組大鼠促炎因子IL-1β水平顯著升高，抗炎因子IL-4水平顯著降低，而益肺宣肺降濁方干預后IL-1β、IL-4水平均顯著逆轉(zhuǎn)。

線粒體功能障礙在VaD的發(fā)病機制中占據(jù)核心地位，其中線粒體動力學失調(diào)在VaD中的具體作用機制備受關(guān)注。研究表明，PGAM5通過調(diào)控線粒體動力學參與細胞衰老和壞死過程。在嚴重受損的線粒體中，PGAM5介導的線粒體過度分裂會導致線粒體功能障礙，進而引發(fā)細胞死亡[]。在病理條件下，活化的MLKL形成寡聚體并轉(zhuǎn)位至質(zhì)膜，進而激活下游效應蛋白PGAM5；PGAM5通過使Drp1去磷酸化，促進Drp1向線粒體募集，從而激活線粒體裂變，導致線粒體碎片化增加，最終引發(fā)線粒體功能障礙。以上研究表明，MLKL/PGAM5/Drp1信號通路是調(diào)控線粒體分裂、影響線粒體動力學、維持線粒體功能與結(jié)構(gòu)完整的關(guān)鍵途徑。

HSP90作為ATP依賴性分子伴侶，通過介導鈣調(diào)磷酸酶依賴的Drp1磷酸化過程，促進Drp1向線粒體轉(zhuǎn)移，進而調(diào)控線粒體分裂[。研究表明，抑制HSP90可促進錯誤折疊蛋白的降解，從而改善記憶障礙并恢復突觸功能[。本研究結(jié)果顯示，益肺宣肺降濁方干預可顯著下調(diào)HSP90蛋白的表達。MLKL是HSP90的直接作用靶點，HSP90通過作用于MLKL的末端，調(diào)控其寡聚化和膜轉(zhuǎn)位過程，抑制HSP90可顯著降低內(nèi)源性MLKL蛋白水平，逆轉(zhuǎn)線粒體裂變并調(diào)節(jié)Drp1的磷酸化[。Drp1Ser637位點磷酸化被認為是神經(jīng)系統(tǒng)疾病和神經(jīng)退行性疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素[2];Ser616位點磷酸化被認為是促進線粒體分裂的激活步驟，促進Drp1在線粒體外膜的定位；Ser637位點磷酸化則被鈣依賴性磷酸酶調(diào)控導致其去磷酸化，從而減少線粒體分裂2]。本研究結(jié)果顯示，益肺宣肺降濁方干預可顯著下調(diào)p-MLKL、p-Drp1（Ser616）的表達；值得注意的是，經(jīng)益肺宣肺降濁方干預后p-Drp1（Ser637）以及MFN1、MFN2的表達均上調(diào)。在腦缺血/再灌注損傷模型大鼠的海馬組織中，HSP90和MLKL的表達顯著升高，并伴隨細胞凋亡和神經(jīng)炎癥反應[22]。此外，線粒體分裂與融合的平衡至關(guān)重要，線粒體過度分裂會抑制融合。MFNs代表完整的線粒體蛋白，MFN1和MFN2是線粒體外膜的關(guān)鍵融合蛋白，作為MFNs的亞型，其GTP結(jié)合域?qū)θ诤现陵P(guān)重要，缺失任一蛋白，均會抑制融合[]。Saita等[23]研究發(fā)現(xiàn)，Drp1水平過高會導致MFNs水平下降。上述結(jié)果表明，HSP90/MLKL/Drp1信號通路可通過調(diào)控線粒體分裂參與VaD發(fā)展過程，抑制該通路可有效改善線粒體功能，減輕VaD大鼠神經(jīng)元損傷和炎癥反應。

本研究結(jié)果還顯示，益肺宣肺降濁方可顯著提高ATP5A蛋白及mRNA表達，表明益肺宣肺降濁方可能通過調(diào)控神經(jīng)炎癥，提高VaD大鼠海馬組織中線粒體復合物活性。此外，本研究結(jié)果顯示，與MOD組比較，經(jīng)益肺宣肺降濁方干預后，各給藥組大鼠HSP90/MLKL/Drp1信號通路相關(guān)指標水平均逆轉(zhuǎn)，表明益肺宣肺降濁方可能通過調(diào)控該通路，維持線粒體動力學平衡，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護作用。

綜上所述，益肺宣肺降濁方可能通過調(diào)控HSP90/MLKL/Drp1信號通路，抑制線粒體分裂，進而維持線粒體動力學平衡，改善線粒體功能，從而起到減輕VaD大鼠的神經(jīng)元損傷和神經(jīng)炎癥反應的作用。

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