6-羥基多巴胺對BV2小膠質細胞鐵蛋白表達的影響

[關鍵詞] 羥多巴胺；鐵蛋白質類；小神經膠質細胞；帕金森病[中圖分類號]R742.5；R341.3 ［文獻標志碼］A [文章編號] 2096-5532（2025）03-0359-04doi：10.11712/jms.2096-5532.2025.61.078 [開放科學（資源服務）標識碼（OSID）][網絡出版]https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20250709.1559.005;

2025-07-10 11：55：34

Efect of 6-hydroxydopamineon the expressonofferitin inBV2 microglialcellsJING Cuiting，LIXiaoqian，QU Yan，XIE Junxia，WANG Jun（Departmentof Physiology，Scholof Basic Medicine，Qingdao University MedicalCollge，Qingdao 266071，China）

[Abstract]ObjetiveToinvestigate theeffctof6-hydroxydopamine（6-OHDA）ontheexpressionofferritin inBV2 microglialcell.MetodsAfterBV2microglialcelswere treated withdiffrentconentrationsof6-OHDA（1o，25，5Oμmol/L） for24hours，theamountoflactatedehydrogenase（DH）released was measured toreflectcellviability，andWesternblotwas usedtomeasurethechanges inthe protein expressionlevelsofferitin heavychain1（FTH1）andferrtinlightchain（FTL）in cells.ResultsCompared with thecontrol group without6-OHDA treatment，the BV2 microglial cels treated with 10μmol/L 6-OHDA for 24 hours had no significant change in the amount of LDH released，and the groups treated with 25 and 50μmol/L 6- OHDA and the maximum enzyme activity control group had a significant increase in the amount of LDH released ?F=92.750，q= （20號 6.799-24.780，Plt;0.001） . Compared with the control group，the BV2 microglial cells treated with 10μmol/L 6-OHDA for 24 hours had significant increases in the protein expression levels of FTHl and FTL （t=3.046，3.131，Plt;0.05） .ConclusionThis study shows that 6-OHDA can increase the expression of ferritin in BV2 microglial cells.

[Key words]oxidopamine；ferritins；microglia；Parkinson disease

帕金森病（PD）是第二常見的中樞神經系統退行性疾病[1]，黑質鐵沉積是PD的重要病理表現[2]前期研究證實，在PD病人的中腦黑質有大量激活的小膠質細胞，這些細胞中存在大量鐵沉積[3]。然而，PD小膠質細胞鐵沉積的機制仍不清楚。鐵蛋白（Ferritin）是最主要的鐵儲存蛋白，鐵蛋白由鐵蛋白重鏈（FTH1）與鐵蛋白輕鏈（FTL）兩種亞基組成。FTH1能夠氧化亞鐵離子，顯示出氧化活性；而FTL則能維持鐵蛋白結構并可以儲存鐵[4-5]。鐵蛋白的表達變化對鐵代謝的改變與鐵沉積的發生至關重要[6]。但是，目前關于6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導BV2小膠質細胞中FTH1和FTL表達變化的研究甚少。因此，本研究使用6-OHDA處理BV2小膠質細胞，檢測6-OHDA對BV2小膠質細胞中FTH1和FTL表達的影響，以期為PD發生發展機制的進一步研究奠定基礎。

1材料和方法

1.1 實驗材料

BV2小膠質細胞購自北京協和醫學院細胞資源中心；胎牛血清（中國依科賽生物科技有限公司），青霉素-鏈霉素混合液（ （100×） 細胞培養專用（北京索萊寶科技有限公司），DMEM高糖培養液（美國Hyclone公司），D-多聚賴氨酸溶液（美國Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），FTH1抗體（成都正能生物技術有限責任公司）、FTL抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）， 抗體（中國博奧森公司）和 β actin抗體（英國Abcam公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與處理取生長狀態良好的BV2小膠質細胞，將其以 2×10⁸/L 的密度接種于預先鋪有D-多聚賴氨酸的6孔板中，待其生長達到 70%～ 80% 融合時，以 10μmol/L 的6-OHDA 處理BV2小膠質細胞，并置于 、體積分數為0.05的 CO₂ 培養箱中培養 24h 。

1.2.2BV2小膠質細胞LDH檢測取生長狀態良好的BV2小膠質細胞，將其以 9×10⁴/L 的密度均勻接種于96孔板中，于培養箱中培養 24h 。培養板中包括無細胞的培養液孔（背景空白對照孔）、未經藥物處理的對照細胞孔（樣品對照孔）、未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔（樣品最大酶活性對照孔）以及藥物處理的細胞孔（藥物處理樣品孔），每組均設6個復孔，并做好標記。以不同濃度（10、25、50μmol/L） 的6-OHDA處理細胞 24h ，在處理時間結束前 于樣品最大酶活性對照孔中加入細胞裂解液，并吹打數次混勻。吸出部分上清到新的96孔板中。配制檢測工作液：乳酸溶液、INT溶液1 （1×） 和酶溶液各 20μL 。在96孔板中加入檢測工作液 60μL ，室溫避光孵育 30min 后測量其 490nm （背景）波長處的吸光度（A）。按照如下公式計算LDH的相對釋放量。LDH相對釋放量 （處理樣品孔A一樣品對照孔A）/（細胞最大酶活性孔 A- 樣品對照孔 A）×100% 。

1.2.3FTH1和FTL蛋白表達檢測以 10μmol/ L的6-OHDA處理BV2小膠質細胞 24h 。按照文獻方法處理細胞[5]，分別用 FTH1（1：1 000） 、FTL（204 （1：1 000） 和 β-actin（1：10000） 的一抗 4^°C 孵育過夜，以TBST清洗3次后再用羊抗兔HRP-IgG（204號 （1：10 000） 二抗室溫孵育 ¹h 。采用ECL發光液進行顯影，掃描后用ImageJ軟件分析結果。

1.3 統計學方法

應用GraphPadPrism9.1軟件進行統計學分析。所得計量資料數據以 表示，兩組均數比較采用獨立樣本 Ψ_tΨ_Ψ 檢驗；多組均數比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用Tukey法。以 Plt;0.05 為差異具有統計學意義。

2結果

2.1 6-OHDA對LDH釋放量的影響

以不同濃度的6-OHDA（0、10、25和 50μmol/ L，n=6 分別作用于BV2小膠質細胞 24h 后，各濃度組LDH的相對釋放量分別為 （1.994±3.581）% 0 8.597±9.581）% ！ （28.890±13.790）% 和 （40.370± 13.090）% ，樣品最大酶活性對照孔LDH的相對釋放量為 （100.000±1.567）% 。與對照組 （0μmol/L 的 6-OHDA處理）相比較， 10μmol/L 的 6-OHDA組LDH釋放量無明顯變化 （q=1.493，Pgt;0.05） ，而 25.50μmol/L 的6-OHDA組與樣品最大酶活性對照組的LDH釋放量均顯著增加，差異具有統計學意義（ F=92.750 ， q=6.799～24.780，P 均 lt; 0.001）。提示 10μmol/L 的6-OHDA對BV2小膠質細胞的細胞膜無明顯的破壞作用，故確定該濃度組為實驗組進行后續實驗。

2.2 6-OHDA對FTH1和FTL蛋白表達的影響

與對照組相比較，實驗組BV2小膠質細胞經過10μmol/L 的6-OHDA處理后，其胞內FTH1和FTL蛋白表達均顯著升高，差異均具有統計學意義（ Δ_t=3.046，3.131，P 均 lt;0.05） 。提示6-OHDA能夠顯著提高BV2小膠質細胞FTH1和FTL蛋白的表達。見圖1和表1。

① 對照組： 0μmol/L 的6-OHDA處理; ② 實驗組： 10μmol/L 的6-OHDA處理。

圖1兩組細胞FTH1和FTL蛋白表達的Westernblot檢測表1兩組細胞FTH1和FTL蛋白表達比較 （n=5，x±s） （2號

與對照組比較， ^*t=3.046，3.131，Plt;0.05 。

3討論

PD是一種常見的中樞神經系統退行性疾病，

PD病人具有典型運動特征和多種非運動表現[7-10]黑質多巴胺能神經元丟失及路易小體的形成是PD的重要病理學特征[11-14]。PD黑質鐵沉積參與了多巴胺能神經元的丟失以及路易小體的形成[15]。目前對于PD中鐵沉積的研究主要集中于多巴胺能神經元，然而研究表明神經膠質細胞對于中樞神經系統穩態的維持至關重要[16-17]。前期研究結果已證實，在PD病人的中腦黑質有大量激活的小膠質細胞，這些細胞中存在大量鐵沉積[3，18]。鐵沉積可以促進小膠質細胞激活，被激活的小膠質細胞釋放大量炎癥因子，引發神經炎癥反應，進而導致多巴胺能神經元的損傷[19-20]

已有的研究表明，鐵的選擇性聚積可能與二價金屬離子轉運體1（DMT1）和鐵轉出蛋白1（FPN1）的異常表達有關，DMT1負責將鐵轉入細胞，FPN1則負責將鐵轉出細胞，它們的表達水平與PD的發病機制密切相關[21-26]。鐵蛋白是最主要的鐵儲存蛋白，鐵蛋白的合成受到翻譯、轉錄與轉錄后水平等機制調節[27]。在正常生理條件下，鐵蛋白、DMT1與FPN1的合成受到鐵調節蛋白/鐵反應元件（IRP/IRE）系統的調節。在鐵蛋白、DMT1與FPN1等mRNA的非編碼區（UTR）含有IRE。當細胞內的鐵濃度降低時，鐵調節蛋白（IRPs）則結合鐵蛋白與FPNmRNA 的 5^′UTR 的IRE，進而抑制蛋白質翻譯并下調鐵蛋白與FPN1表達，IRPs結合DMT1mRNA的 3^′UTR 的IRE增加其mRNA 的穩定性，DMT1蛋白表達增加。當細胞內鐵含量增加時，IRPs失活，不與IRE結合，增加鐵蛋白與FPN1的表達，下調DMT1的表達。增加的鐵蛋白將過量的 Fe²⁺ 氧化為 Fe³⁺ ，并將 Fe³⁺ 儲存于蛋白質外殼中，從而對抗芬頓（Fenton）反應，減少羥自由基的產生，保護細胞免受氧化應激損傷[28-33]。IRPs又分為兩種類型，鐵調節蛋白1（IRP1）和鐵調節蛋白2，在大多數哺乳動物中IRP1的含量明顯高于鐵調節蛋白2，IRP1被認為是細胞鐵代謝轉錄后調節的主要因子[10，34]

6-OHDA是一種神經毒素，可誘導多巴胺能神經元死亡，常用于構建PD細胞與動物模型[35-36] 。研究發現，6-OHDA可以激活IRP1，而IRP1可誘導DMT1的表達，下調FPN1的表達，使鐵的攝取增加，轉出減少，導致小膠質細胞鐵積累[19，21-25]。小膠質細胞內鐵含量增加，使IRPs失活，不能與IRE結合，增加鐵蛋白的表達。這與我們的實驗結果一致。本文研究結果表明，6-OHDA處理BV2小膠質細胞后胞內FTH1、FTL表達顯著上升，我們猜測鐵蛋白表達的增加可能與IRP1的上調有關。但PD中小膠質細胞、少突膠質細胞和神經元等各細胞類型的鐵代謝特點和調節機制目前仍不十分明確，需要進一步探索。

鑒于有大量證據證明鐵積累與PD間的聯系，科學家們嘗試了一些針對鐵的治療方法，其中鐵螯合劑去鐵酮片已進入臨床試驗。鐵沉積的發生機制十分復雜，目前我們對PD中鐵沉積機制的認識仍不完善[37]。因此，需要進一步探究鐵沉積的發生機制及其在PD發展進程中的作用，并為針對鐵沉積的 PD療法的探討提供有價值的見解[38]。本實驗僅進行了小膠質細胞系的體外實驗，后續我們將在動物模型中進一步證實，探究小膠質細胞鐵代謝調控的具體機制及小膠質細胞鐵沉積與PD之間的關聯，以期為神經退行性疾病新療法的開發奠定基礎。

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