利用同步熒光法同時測定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的實驗教學研究

文章編號：1671-489X（2025）14-0117-03DOI：10.3969/j.issn.1671-489X.2025.14.117

0 引言

生物學科本科生在畢業課題研究中經常用熒光色譜法作相關檢測，也經常將氨基酸（蛋白質組成的基本結構單元）作為研究對象。無論是在生物化學中對蛋白質結構與功能進行深入探究，在食品科學中對營養成分進行精準分析，還是在醫學研究中對疾病相關生物標志物進行檢測，氨基酸含量與組成的精確數據都不可或缺[]。對單一的不同氨基酸進行分別測定導致實驗的操作過程比較冗繁，導致測定時間較長。對不同氨基酸混合物進行測定時，用常規熒光法不能實現混合物中組分的同時測定，存在光譜重疊嚴重、選擇性差等問題，因此，多采用預分離或化學預處理后分析的方法[2-5]，但這種方法導致實驗流程復雜，大大加重了學生的實驗任務，且實驗成本較高。同步掃描熒光光譜技術是解決這個問題的理想手段之一，其具有簡化操作、窄化光譜、提高選擇性等顯著優勢[6-8]，能夠實現在復雜的樣品體系中對氨基酸的精準識別與定量，為科學研究與質量控制提供更為可靠的依據。

目前，高校相關實驗教學仍以傳統熒光法為主，學生對同步熒光技術的原理和儀器操作缺乏系統性學習和訓練。本研究聚焦利用同步熒光法同時測定多種氨基酸，旨在通過系統的教學實踐使學生深入理解并熟練掌握熒光分光光度計同步熒光法的工作原理、操作技巧和數據處理方法。在教學過程中，學生將親身體驗從樣品制備到結果分析的完整實驗流程，深刻領悟同步熒光法在氨基酸測定中的精妙之處，培養嚴謹的科學思維與精湛的實驗技能。這不僅有助于提升學生的實驗素養，培養學生分析、解決問題的能力和綜合應用知識的能力，為其今后從事相關科研工作奠定堅實的基礎，還可以為實驗教學改革提供參考，推動實驗教學朝著更加注重培養學生的實踐能力與創新思維的方向發展。

1實驗儀器和測定原理

利用熒光分光光度計的同步掃描功能實現對波長差的精確控制，用于多組分熒光物質的同時測定。熒光分光光度計是利用物質吸收特定波長光后發射出特征熒光的特性開展光譜檢測。當樣品被儀器激發光源發射的特定波長的光照射時，分子中的電子從基態躍遷到激發態，在返回基態過程中發射特征熒光。同步熒光法通過同時掃描激發波長和發射波長，在特定的波長差下獲得熒光信號，提高分析的選擇性和靈敏度。

色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）是天然氨基酸中僅有的能發射熒光的組分，可以用熒光法測定，但三者的激發光譜和發射光譜互相重疊。等波長差（ Δλ=λem-λ ex）同步掃描技術可以通過 Δλ 的選擇實現多組分混合物的選擇性測定。研究表明，當酪氨酸和色氨酸共存時，利用酪氨酸（ Δλlt;15nm ）和色氨酸（ Δλgt;60nm ）的特征光譜進行同步掃描可以實現兩組分的分別測定。當同時含有這三種氨基酸時，可在 pH=7.4 的緩沖介質中，以單一△ λ=55nm 進行同步掃描，利用苯丙氨酸在217nm 、酪氨酸在 232nm 、色氨酸在 284nm 處的同步熒光峰無顯著重疊實現混合物的同時測定。測定線性范圍為：苯丙氨酸 0.07～5mg/mL 、酪氨酸 0.02～ 1mg/mL 、色氨酸 0.001～0.5mg/mL ，酪氨酸在268nm處的微弱同步熒光信號對色氨酸的測定有一定干擾，可按照下式校正：

F=F₂₈₄-KF₂₃₂-F₀

式中 F 為混合物中真正由色氨酸在 284nm 處產生的同步熒光信號值， F₂₈₄ 為波長 284nm 處測定的混合物同步熒光信號值， F₀ 為空白溶液在 284nm 處產生的同步熒光信號值， F₂₃₂ 為混合物中酪氨酸在232nm 處的同步熒光信號值， K 為酪氨酸在 284nm 處與 232nm 處同步熒光信號值的比值，可由單組分酪氨酸求得。

2實驗儀器操作要點

開啟熒光分光光度計后，需預熱30分鐘左右以穩定光源和檢測器，使儀器各部件達到穩定的工作狀態，確保測量數據的準確性和重復性。

2.1 pH的確定

在pH對同步熒光（ ）信號值的影響實驗中，要求學生根據色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在不同pH（6.0、7.4、8.4、9.8）緩沖溶液中產生的同步熒光峰強度選取適宜的緩沖溶液pH。

2.2熒光激發、發射和同步光譜的分別測定

在選取的pH緩沖介質中，分別測定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸各自的熒光激發、發射光譜和同步 ）光譜，確定三種氨基酸各自的峰值激發、發射和同步波長。

2.3標準混合溶液激發、發射和同步光譜的測定

移取一定體積的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸標準溶液進行混合，測定混合溶液熒光激發、發射光譜和同步（ ）光譜，確定其峰值波長，并與2.2部分所述的熒光光譜圖進行比較。

2.4波長差 Δλ 的確定

Δλ 決定了同步光譜的分辨率。在 Δλ 的選擇實驗中，要求學生用一系列不同 Δλ （ 10nm 、30nm 、 50nm 、 60nm 、 70nm ）對色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸混合溶液進行同步掃描。根據色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸共存時和各組分單獨存在時的同步熒光光譜比較結果，選用較為適宜的 Δλ 。其中苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分別對應 217nm ， 232nm 和 284nm 處同步熒光峰。 Δλ 的選擇直接影響同步熒光峰的峰形、峰位和強度，實驗中應保持一致。

2.5 標準曲線繪制

選取實驗確定的波長差 Δλ ，要求學生同步掃描不同濃度系列的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸標準混合溶液，分別在 217nm 、 232nm 和 284nm 處讀取各氨基酸的同步熒光信號值，繪制其同步熒光信號值與濃度的標準曲線，得到線性回歸方程，確定各氨基酸的標準曲線線性范圍。

2.6混合溶液測定

要求學生在確定的實驗條件下測定三種氨基酸混合溶液的同步熒光信號值，根據標準曲線方程計算混合物中各氨基酸的含量，注意色氨酸的含量校正。

3 教學策略

本實驗教學旨在幫助本科生了解儀器的新功能，掌握新的實驗方法，并將之應用于更多類似的實驗研究，充分調動學生的積極性，拓寬學生的知識面，幫助學生提高實踐操作能力和創新能力。

3.1分階段教學模式

3.1.1 理論培訓

將一個班級的學生分成五組，每組八人，第一周每天下午安排一組學生進行儀器原理、構造，數據分析，注意事項等方面的系統培訓。通過利用PPT進行演示、講解等方式，向學生詳細闡述同步熒光法的基本原理，包括熒光產生的機制、同步掃描的概念、與傳統熒光法的區別和優勢、氨基酸的結構與熒光特性的關聯等，讓學生在理論層面理解實驗基礎。例如，講解不同氨基酸的熒光基團如何在特定波長下被激發產生熒光和同步熒光法如何通過選擇合適的波長差從而提高選擇性。

3.1.2 操作演示

在理論培訓的基礎上開展操作演示教學。教師現場示范儀器操作流程，向學生展示儀器的各個部件，如光源、單色器、樣品池、檢測器等，并詳細講解其功能與操作要點，重點講解參數設置的優化策略。例如，演示如何調節激發波長和發射波長范圍、設置狹縫寬度和掃描速度等參數，使學生在掌握儀器基本原理的基礎上直觀感受儀器的操作流程與規范，從而加深理解，熟練操作儀器，充分掌握同步熒光技術。

3.1.3 合作實踐

將每組再分成兩個小組，即每小組四人。第二周每天上午、下午各安排一個小組完成氨基酸同步熒光法測定的具體操作，進行從樣品制備到數據分析的全流程實驗，包括樣品準備、儀器測定、數據記錄與分析等。在小組合作中，學生可以互相交流討論，如在樣品制備過程中討論如何準確稱取氨基酸樣品、如何配制不同濃度的標準溶液等，在儀器操作時互相提醒操作步驟與注意事項。這樣可以培養學生的團隊協作能力與溝通能力，也可以讓學生從不同角度思考問題，加深對實驗的理解。

3.2 問題導向教學

在教學過程中提出問題。例如，教師給出氨基酸樣品并向學生提問：“在制備氨基酸樣品時，我們需要考慮哪些因素？比如溶劑的選擇、濃度范圍的確定，它們會對測定結果產生怎樣的影響？”讓學生討論并設計合理的樣品制備方案。設置儀器參數時，教師提問：“如何確定合適的激發波長和發射波長范圍？是根據什么來優化這些參數？”引導學生回顧同步熒光法原理中關于波長選擇與氨基酸結構的關系，通過小組討論嘗試設置初始參數。在學生設置參數后，教師追問：“如果測定結果不理想，如熒光強度太弱或者峰形不明顯，我們應該調整哪些參數？如何判斷調整方向是否正確？”通過以問題為導向的教學，引導學生思考并通過實驗探索解決問題，提高學生的獨立思考能力和問題解決能力。

3.3 過程性考核

第三周安排考核。采用抽簽的方式開展過程性考核，包括理論考核、操作考核、綜合答辯等多維度的考核，全面考查學生在同步熒光法測定氨基酸實驗教學過程中的知識掌握情況、操作技能、學習態度、團隊協作能力和問題解決能力，綜合評價學生的實驗能力和水平，促進學生積極參與實驗，提升實驗教學質量與學生綜合素養。課程最后，要求學生進行總結，思考每個實驗步驟的目的和影響實驗結果的因素，分析異常數據出現的原因并提出改進方案。強化學生對實驗儀器的理解與掌握程度，幫助他們做到觸類旁通，將該實驗技術應用于更多研究內容。

4結束語

本實驗教學研究通過建立“理論一演示一實踐一考核”四位一體的模式，以讓學生直接進入實驗室操作儀器為教學形式，真正做到了理論和實踐相結合，有效提升了學生的實踐操作能力與科研素養，為相關領域培養具備扎實實驗技能的人才。通過新的實驗技術激發學生的學習熱情，調動他們的學習積極性，幫助他們提高儀器操作能力、掌握實驗技巧，并初步建立獨立實驗意識，從而拓展視野，站在科研尖端化和國際化的角度思考和看待本專業領域的發展。同時，拓寬學生獲取知識的廣度，使學生在今后的學習與科研中遇到類似的物質測定需求時能夠舉一反三，善于用所學知識解決實際問題。這樣可以切實提高人才培養質量，增強學生的就業競爭力，為他們的學術研究與技術創新奠定堅實基礎。

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