聚酮合酶模塊中酮合成酶的研究進(jìn)展

中國(guó)分類號(hào)：R9，Q71 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-8689（2025）07-0729-11

Research progress on ketosynthase in polyketide synthase module

AbstractKetosynthase （KS），one member of the polyketide synthase （PKS） complex enzyme，can catalyze the decarboxylation of the acyl coenzyme A derivatives to be loaded onto the phosphopantetheine（Ppant） chain of acyl carrier protein （ACP）and realize the extension of the polyketide chain，so it plays an important role in polyketide biosynthesis.In this paper，the structureand functionofKS，its interaction with other domains，and itsapplication in antibiotic biosynthesis were reviewed. Itcould provide a theoretical basis for the studyof the functionand regulatory mechanism of KS domains， the improvement of polyketide production，and the development of new polyketide antibiotics.

Key wordsKetosynthase; Polyketide; Antibiotic biosynthesis; Domain engineering

聚酮化合物（polyketides）是一類含有復(fù)雜多環(huán)結(jié)構(gòu)和多樣功能基團(tuán)、具有廣泛生理活性的天然有機(jī)化合物，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，醫(yī)學(xué)廣泛應(yīng)用的抗生素，如大環(huán)內(nèi)酯類紅霉素、抗真菌藥物的棘球菌素和抗腫瘤藥物埃博霉素[等均主要來(lái)源于放線菌和真菌等微生物產(chǎn)生的聚酮化合物[2]。

聚酮化合物的生物合成主要依賴于聚酮合酶（polyketidesynthase，PKS）。PKS是一類大型多功能酶，負(fù)責(zé)將小分子羧酸通過(guò)反復(fù)脫羧縮合連接成長(zhǎng)鏈聚酮化合物[3]。PKS基因簇一般由酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT）、酰基載體蛋白（acylcarrierprotein，ACP）和酮合成酶（ketosynthase，KS）3個(gè)核心結(jié)構(gòu)域以及酮基還原酶（ketoreductase，KR）、脫水酶（dehydratase，DH）、烯酰還原酶（enoyl reductase，ER）、硫酯酶（thioesterase，TE）等修飾結(jié)構(gòu)域組成。KS又稱3-氧酰基合成酶或β-酮酰基合成酶[4]，通過(guò)脫羧縮合反應(yīng)將聚酮中間體從上游模塊轉(zhuǎn)移到下游模塊的ACP結(jié)構(gòu)域上，催化C-C鍵形成，實(shí)現(xiàn)了聚酮鏈的延伸。KS結(jié)構(gòu)域不僅對(duì)形成不同生物活性功能的天然產(chǎn)物具有重要作用[5]，且在PKS模塊中各結(jié)構(gòu)域之間具有最大和最保守的相互作用表面，在鏈長(zhǎng)的確定、產(chǎn)品保真度和通路通量控制發(fā)揮著重要作用。因此了解KS的結(jié)構(gòu)與功能不僅有助于揭示聚酮化合物生物合成的內(nèi)在機(jī)制，還對(duì)工業(yè)上改造聚酮合酶從而提高聚酮化合物的產(chǎn)量、發(fā)掘新型聚酮化合物抗生素提供理論支持。本文旨在對(duì)KS結(jié)構(gòu)域及其作用機(jī)制的研究進(jìn)行綜述，為聚酮化合物的生產(chǎn)和在抗生素研發(fā)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1KS結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)基礎(chǔ)

1.1KS的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

KS結(jié)構(gòu)域是聚酮化合物合成的關(guān)鍵酶之一，不僅為PKS重要組分，也存在于I型脂肪酸合成酶（fattyacidsynthase，F(xiàn)AS）中。KS在PKS中為離散性單功能酶，在FAS則是多個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起的聚合酶。雖然PKS與FAS裝配線中的組分各不相同，但KS結(jié)構(gòu)域是脂肪酸和聚酮化合物合成中的關(guān)鍵碳-碳鍵催化酶。KS的氨基酸序列在細(xì)菌、真菌和植物中高度保守，特別是在催化核心區(qū)域和功能結(jié)構(gòu)域同源性達(dá)到 90% 以上[7]，Cys-His-His催化三聯(lián)體是重要的區(qū)域功能區(qū)，負(fù)責(zé)了聚酮鏈的縮合反應(yīng)，在不同來(lái)源的KS結(jié)構(gòu)域均表現(xiàn)出高度保守性，Cys作為親核試劑攻擊底物的羰基碳，而His則扮演質(zhì)子供體的角色。對(duì)擬南芥β-酮脂酰輔酶A合酶的誘變分析發(fā)現(xiàn)KS的Cys-His-Asn/His催化殘基具有將內(nèi)二酰輔酶A與長(zhǎng)鏈酰基輔酶A連接的功能[8]。

在聚酮化合物生物合成中KS結(jié)構(gòu)域通常形成同源或異源的二聚體[9]，而與二聚體化相關(guān)的結(jié)構(gòu)域在不同KS結(jié)構(gòu)域中也表現(xiàn)出保守性。KS底物結(jié)合口袋由二聚體界面的多個(gè)殘基組成，通過(guò)與底物相互作用決定了KS對(duì)底物的特異性；KS結(jié)構(gòu)域還具有膜錨定結(jié)構(gòu)域和酰基載體蛋白（acylcarrier protein，ACP）結(jié)構(gòu)域[1等其他功能區(qū)，這些功能區(qū)序列在不同KS結(jié)構(gòu)域中具有一定的保守性，這為研究KS結(jié)構(gòu)域在不同生物中的功能和相互作用提供了依據(jù)，通過(guò)比較不同來(lái)源KS結(jié)構(gòu)域的保守序列，可以預(yù)測(cè)和改造KS結(jié)構(gòu)域以實(shí)現(xiàn)新聚酮化合物的生物合成功能。

1.2 KS的分類

KS種類繁多，已發(fā)現(xiàn)有20，000多個(gè)。根據(jù)KS氨基酸組成及其催化特征，Chen等[1]將其分成5個(gè)家族，并模擬了疊加的KS晶體結(jié)構(gòu)（圖1）。

注：KS1（黃色）：自大腸埃希菌β-酮酰-ACP合成酶III；KS3（青色）：來(lái)自糖多孢紅霉菌DEBS2；KS4（粉色）：來(lái)自花生二苯乙烯合成酶。

圖1疊加的KS晶體結(jié)構(gòu)[1] Fig.1Superimposed KS crystal structures[]

KS1家族為KASI或其變體，主要由細(xì)菌產(chǎn)生。KASIII也稱3-氧酰基-ACP合成酶III和β-酮酰基-ACP合成酶III，是一種離散蛋白質(zhì)，不與其他FAS和PKS共價(jià)連接，在I型（游離的）脂肪酸延伸循環(huán)中催化初始縮合反應(yīng)。KS2主要由植物產(chǎn)生，通常為長(zhǎng)鏈脂肪酸延伸酶/縮合酶和3-酮酰輔酶A合成酶。KS3是一個(gè)非常大的家族，由細(xì)菌和真核生物的3-酮酰-ACP合成酶I和I組成，通常存在于多結(jié)構(gòu)域FAS和PKS中。KS4中的查爾酮合酶、二苯乙烯合酶和柚皮素-查爾酮合酶大多來(lái)自真核生物。KS5成員都來(lái)自真核生物，大部分是由動(dòng)物產(chǎn)生的，它們主要是脂肪酸延伸酶。其中KS1、KS2、KS3和KS4在一級(jí)結(jié)構(gòu)上略有相似，并且具有相似的催化三元化合物，它們以相同或相似的機(jī)理催化基本相同的反應(yīng)。KS1-KS4似乎是同一家族的一部分，目前尚無(wú)關(guān)于KS5屬于這個(gè)家族的證據(jù)。在聚酮化合物或脂肪酸生物合成途徑中，KS1和KS3使用丙二酰輔酶A作為延長(zhǎng)劑，而KS2和KS4則使用丙二酰-ACP，KS1、KS2和KS4將延長(zhǎng)劑添加到酰基-CoA部分，而KS3成員將延長(zhǎng)劑添加到酰基-ACP分子上，KS5中的脂肪酸延伸酶與酰基輔酶A縮合成丙二酰輔酶A[12]。所有已知的KS1、KS3和KS4三級(jí)結(jié)構(gòu)都具有硫解酶樣折疊，具有五層α-β-α-β-α結(jié)構(gòu)[13]。KS2和KS5目前沒(méi)有晶體結(jié)構(gòu)[14]。

2KS結(jié)構(gòu)域的催化機(jī)制

2.1KS與底物的相互作用

在PKS裝配線上另一種關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域ACP是一種小的4螺旋束，在聚酮化合物合成中與KS協(xié)調(diào)作用，通過(guò)穿梭在底物和中間體之間，與每個(gè)催化結(jié)構(gòu)域相互作用。功能性ACP（holo-ACP）需要在翻譯后將Ppant安裝到Ser殘基上，其中Ppant為底物拴系提供硫醇基團(tuán)[15]。在KS結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)的L形口袋由Ppant結(jié)合口袋和酰基鏈結(jié)合口袋組成，它們大致相互垂直。Ppant結(jié)合口袋有兩個(gè)高度保守的Thr殘基（圖2中的T305和T307），它們與Ppant的第二酰胺的氧形成極性接觸，并且可能與進(jìn)入活性位點(diǎn)時(shí)通過(guò)這些Thr殘基的其他羰基（如來(lái)自硫酯和丙二酸的羰基）相互作用，將Ppant部分錨定在相當(dāng)寬敞的Ppant口袋的一側(cè)，更有利于與底物結(jié)合[16（圖2a）。在PKS中的一個(gè)Thr殘基被Ser取代，這兩個(gè)殘基的側(cè)鏈提供的極性接觸電位卻存在于所有KS中。如果這些殘基中的任何一個(gè)突變?yōu)锳la都導(dǎo)致在IgaPKS（多烯）和AntPKS（聚酮）系統(tǒng)酶活性受損[17]。并且該結(jié)構(gòu)在ACP與另一個(gè)結(jié)構(gòu)元素之間起到中介作用，促進(jìn)磷酸鹽和Ppant的第一酰胺的極性接觸[16]（圖2b）。

與Ppant結(jié)合口袋的高相似性相反，不同類別的II型KS的底物隧道由于底物的多樣性而具有不同的性質(zhì)。據(jù)報(bào)道IgaKS高度保守的D113的酸性側(cè)鏈會(huì)排斥β-酮酰基產(chǎn)物的重新加載，產(chǎn)生三酮的D113A突變體[18]；生物素生物合成的前體吡啶酰甲酯也是通過(guò)FAS合成的，表明甲酯基可以放入KS底物口袋中[9]。鮑曼不動(dòng)桿菌的芳基多烯KS中的ApeO-ApeC和ApeR在口袋中具有Phe和Tyr殘基，可以與底物的苯環(huán)堆疊[20]；六環(huán)環(huán)丁酯結(jié)合的AntKS-CLF結(jié)構(gòu)揭示了結(jié)合口袋中的羰基取向，導(dǎo)致其與底物結(jié)合更穩(wěn)定[21]。

2.2KS與ACP的協(xié)同作用

PKS通過(guò)催化前體小分子羧酸進(jìn)行反復(fù)地脫羧

圖2FabF的Ppant結(jié)合口袋[16] Fig.2The Ppant binding pocket of FabF[16]

注：（a）兩個(gè)蘇氨酸殘基的配位為Ppant插入鋪平了親水路徑；（b）Ppant結(jié)合袋的極性接觸網(wǎng)絡(luò)。

縮合形成多種聚酮體，在含有KS-AT-（DH-KR-ER）-ACP結(jié)構(gòu)域的多肽能夠進(jìn)行一輪多酮鏈伸長(zhǎng)和精化[22-23]，這種結(jié)構(gòu)域順序在脊椎動(dòng)物脂肪酸、迭代PKS和順式AT型PKS中是保守的；而在反式ATPKSs中KS結(jié)構(gòu)域似乎與上游模塊的ACP共同進(jìn)化，其進(jìn)化單元可表示為（DH-KR-ER）-ACP-KS-AT或AT-（DH-KR-ER）-ACP-KS。Nivina等[24]觀察到在反式AT組裝線中接受類似底物的KS與ACP聚集一起，這表明KS與其上游的結(jié)構(gòu)域合作最密切。Helfrich等[25]發(fā)現(xiàn)反式ATPKSs的KS結(jié)構(gòu)域通常與上游ACPs和修飾結(jié)構(gòu)域共同進(jìn)化，從而能夠更精確地預(yù)測(cè)生物合成分子結(jié)構(gòu)。而在順式ATPKS的KS結(jié)構(gòu)域與其上游模塊的ACP結(jié)構(gòu)域之間的共同進(jìn)化信號(hào)不夠強(qiáng)[26]。Zhang等[27]比較了4種已知產(chǎn)生氨基多元醇的大型PKS（每個(gè)PKS長(zhǎng)25-30個(gè)模塊），發(fā)現(xiàn)來(lái)自巨型裝配線的結(jié)構(gòu)域也存在相同的系統(tǒng)發(fā)育模式AT-DH-ER-KR-ACP-KS。Witkowski等[28]通過(guò)構(gòu)建KS結(jié)構(gòu)域和ACP結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用所必需的4'-磷酸腺苷的兩個(gè)獨(dú)立突變體，還發(fā)現(xiàn)KS和ACP結(jié)構(gòu)域可以跨亞基界面合作。在匹克霉素PKS模塊5（PikAIII）結(jié)構(gòu)中的ACP和KS結(jié)構(gòu)域都處于酰化狀態(tài)。在具有五酮基-ACPi-1的復(fù)合體中，來(lái)自前一個(gè)模塊的上游ACPi-1將前一個(gè)組件的五酮基產(chǎn)物輸送到KS活性位點(diǎn)側(cè)入口附近的位點(diǎn)。在與甲基丙二酰-ACPi的復(fù)合物中，模塊ACPi將甲基丙二酰基構(gòu)建塊輸送到較低的活性位點(diǎn)入口[29]。ACP與KS的相互作用機(jī)制如圖3[30]。

圖3ACP與KS相互作用機(jī)制[30] Fig.3 The interaction mechanism between ACP and KS[30

從1990年紅霉素合成酶的測(cè)序開(kāi)始，在順式-AT裝配線模塊的邊界上就被定義為KS為模塊的上游邊界，而ACP在下游邊界[31]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)通過(guò)KS-ACP模塊交換（如將KS結(jié)構(gòu)域置于PKS模塊最下游，而將ACP放置在最上游）可能會(huì)提高聚酮化合物產(chǎn)率。Miyazawa等[2]采用這種更新的模塊邊界設(shè)計(jì)的PKS明顯優(yōu)于傳統(tǒng)模塊邊界的PKS。在重新定義的模塊排序中，KS與其上游ACP及加工酶密切合作，從而確保了正確加工中間體，并且KS在聚酮化合物鏈傳遞到下一個(gè)模塊之前，可以確保會(huì)發(fā)生脫水或差向異構(gòu)化等反應(yīng)。因此ACP下游的KS在其中通常扮演著看門(mén)人的角色，確保只有一個(gè)模塊的酶產(chǎn)生的單一中間體被傳遞到下游。KS-ACP-KS結(jié)構(gòu)域在NRPS-PKS界面上也存在于其他混合肽-聚酮生物合成機(jī)制中，如根霉素和花蕊A[33-34]；而在ChiD-KS10和RhiB-KS2中[35-36]，其第一個(gè)活性位點(diǎn)His的突變即可使KS的脫羧功能喪失，僅能催化ACP或PCP之間的酰基或肽基轉(zhuǎn)移，代表了混合多肽和聚酮天然產(chǎn)物生物合成中NRPS和PKS之間功能串?dāng)_的一種新機(jī)制。此外KS-ACP相互作用在底物傳遞過(guò)程中也起著重要作用，操控KS-ACP接口已經(jīng)在I型FAS和PKS裝配線的工程構(gòu)建顯示成功[37]，展示了工程設(shè)計(jì)FASII和PKSII途徑的廣闊前景。KS結(jié)構(gòu)域與ACP結(jié)構(gòu)域的相互作用作為PKS生物合成過(guò)程中的核心，對(duì)于鏈的傳遞和延伸起著決定性作用。

3KS結(jié)構(gòu)域的多樣性和功能分化

3.1KS結(jié)構(gòu)域的多樣性

Nivina等[24]發(fā)現(xiàn)在PKS裝配線中KS結(jié)構(gòu)域可分為兩類，分別對(duì)應(yīng)于順式AT和反式AT。順式AT型PKS中KS結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通常遵循宿主生物的系統(tǒng)發(fā)育模式，在單個(gè)生物合成基因簇中具有較高的序列同一性；在較小程度上也有物種內(nèi)具有不同的裝配線[38-39]。也有例外，混合NRPS/PKS體系中的KS結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是將上游NRPS模塊中的肽中間體連接到聚酮擴(kuò)展單元上，另一個(gè)是脫羧性KS結(jié)構(gòu)域，其活性位點(diǎn)Cys殘基被Gln取代。這兩個(gè)組形成了獨(dú)立的分支，它們非常接近于反式AT型PKS的對(duì)應(yīng)域[40]。其中相似性較高的KS幾乎都是延伸結(jié)構(gòu)相似的聚酮中間體[41-42]。而在反式AT型PKS的不同位置發(fā)現(xiàn)具有縮合能力不足的KS0的非伸長(zhǎng)模塊。通常KS0缺乏縮合活性是由HGTGT基序保守的His殘基突變所導(dǎo)致的。然而這種看似不活躍的KS實(shí)際上通過(guò)催化酰基鏈中間產(chǎn)物的易位在反式ATPKS中發(fā)揮著重要作用[43]。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)來(lái)自反式AT型PKS的KS結(jié)構(gòu)域比順式AT型PKS的KS結(jié)構(gòu)域更少混雜[44]。

3.2KS結(jié)構(gòu)域的功能分化

研究表明有些特殊的KS結(jié)構(gòu)域在PKS系統(tǒng)中行使不同的功能，比如KS在發(fā)揮其擴(kuò)展中間體的作用之前，可以選擇適當(dāng)加工的中間體。Bretschneider等[45]發(fā)現(xiàn)在根瘤菌的聚酮化合物生物合成過(guò)程中KS結(jié)構(gòu)域在乙烯基鏈分支中起關(guān)鍵作用。He等[46發(fā)現(xiàn)一個(gè)復(fù)雜的反式AT型PKS系統(tǒng)——FR901464，涉及一個(gè)非末端的TE結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)突變的KS結(jié)構(gòu)域，KS結(jié)構(gòu)域只負(fù)責(zé)將底物轉(zhuǎn)移到下一個(gè)結(jié)構(gòu)域。此外III型PKS同源二聚體的KS結(jié)構(gòu)域通常同時(shí)具有催化酮化合物的延伸和底物環(huán)化的功能，但是在替萘唑酸合成酶l（tenuazonic acid synthetase 1）中KS結(jié)構(gòu)域僅具有環(huán)化作用而不具備催化酮基延伸的作用，其底物環(huán)化是通過(guò)催化 ³²²H is殘基從底物中的活性亞甲基部分提取質(zhì)子而觸發(fā)的。此外還發(fā)現(xiàn)稻瘟菌的細(xì)氮苯酸合成酶1中KS混雜接受氨基酰基底物，且這種混雜性可以通過(guò)酶底物結(jié)合口袋中的單個(gè)氨基酸取代而增加[47-48]。Huang等[49]研究發(fā)現(xiàn)利納霉素（linamycin，LNM）PKS模塊3在混合NRPS-PKS接口上存在兩個(gè)KS結(jié)構(gòu)域（KS1和KS2），這兩個(gè)KS域在系統(tǒng)發(fā)育上更類似于模塊化I型PKS的KS域。KS1和KS2共同介導(dǎo)了肽基中間體從NRPS模塊2轉(zhuǎn)移到PKS模塊3。其中KS1具有突變的催化三聯(lián)體（C2090-A2225-H2264），表明缺乏典型KS結(jié)構(gòu)域（C-H-H）的脫羧功能。所以在LNM生物合成過(guò)程中KS1作為酰基轉(zhuǎn)移酶催化NRPS模塊2的PCP-肽基中間體轉(zhuǎn)移到PKS模塊3的ACP上，生成ACP-肽基中間體；KS2催化肽基-S-ACP1與丙二酰-S-ACP2之間的脫羧縮合，用聚酮擴(kuò)展劑完成肽基中間體的延伸。

4KS在抗生素研發(fā)中的作用

4.1KS在經(jīng)典抗生素合成中的作用

KS在天然產(chǎn)物合成中扮演著至關(guān)重要的角色，特別是在抗生素的研發(fā)中，KS通過(guò)精確地搭建起復(fù)雜而精細(xì)的聚酮骨架，對(duì)于構(gòu)建具有醫(yī)療價(jià)值的抗生素至關(guān)重要。

紅霉素作為一種聚酮化合物，在其生物合成中KS不僅催化從丙二酰輔酶A到長(zhǎng)鏈酰輔酶A的縮合形成紅霉素的聚酮骨架，還通過(guò)其保守的Cys-His-Asn催化三聯(lián)體確保了聚酮鏈的精確延伸和環(huán)化，從而塑造出紅霉素的多環(huán)結(jié)構(gòu)[50]。這種精確的分子構(gòu)建不僅體現(xiàn)了KS在紅霉素生物合成中的精細(xì)調(diào)控，也展示了其在創(chuàng)造具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的抗生素中的關(guān)鍵作用。同樣四環(huán)素類抗生素的生物合成[51]也涉及一個(gè)復(fù)雜的PKSⅡI途徑，其中KS的活性和底物特異性決定了聚酮鏈的延伸和最終產(chǎn)物的多樣性[52]。KS不僅參與聚酮鏈的起始步驟，通過(guò)KS的特異性決定四環(huán)素類抗生素特有的丙二酰基氨基化起始單元，還通過(guò)其對(duì)不同酰基供體的選擇性，影響著四環(huán)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，對(duì)四環(huán)素的抗菌活性至關(guān)重要[53]。

此外KS還在合成多種抗生素中扮演著關(guān)鍵角色，包括匹馬霉素（pimaricin）[54]、制霉菌素A1（nystatinA1）[55]、四霉素（tetramycin）[56]、兩性霉素B（amphotericin B）[57-58]、菲律賓菌素（filipin）[59]以及克念菌素（candicidin）[60]等（圖4）抗生素的生物合成過(guò)程中，KS的參與不僅提高了化合物合成的精確性，還確保了最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)多樣性和生物活性，進(jìn)一步豐富了抗生素的種類和應(yīng)用范圍。

4.2KS在新型抗生素開(kāi)發(fā)中的潛力

隨著病原菌耐藥性問(wèn)題的日益嚴(yán)重，KS在新型抗生素開(kāi)發(fā)中的潛力受到了廣泛關(guān)注。通過(guò)基因工程技術(shù)可對(duì)KS結(jié)構(gòu)域進(jìn)行定向改造，拓寬其底物特異性，推動(dòng)新結(jié)構(gòu)和活性抗生素分子的合成。Gladiolin是一種新型大環(huán)內(nèi)酯抗生素（圖5），對(duì)結(jié)核分枝桿菌有顯著抑制活性[61]。而etnangien是一種高度不穩(wěn)定的抗生素[2]，與gladiolin結(jié)構(gòu)相似。因?yàn)間ladiolin不含有etnangien中易降解的六烯基團(tuán)[63]，所以gladiolin穩(wěn)定性更高，即使在常規(guī)條件下也能保持活性，并且其對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性較低[64，這些特性使gladiolin成為開(kāi)發(fā)新型抗生素藥物的有力候選。

在gladiolin的生物合成途徑中，gbnD1-D6基因簇編碼的6個(gè)trans-AT型PKS，與周圍的聚酮加工酶和相關(guān)蛋白編碼基因共同構(gòu)成了一個(gè)精密的生物合成機(jī)器。gbnB、gbnN和gbnP編碼的trans-AT酶在聚酮鏈的起始和延伸步驟中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[61]。GbnB特異性地作用于琥珀酰輔酶A，催化琥珀酰基轉(zhuǎn)移到KS結(jié)構(gòu)域下游的ACP結(jié)構(gòu)域，隨后將琥珀酰單元反向轉(zhuǎn)移到KS的活性位點(diǎn)Cys上，從而啟動(dòng)生物合成過(guò)程。GbnN則對(duì)丙二酰輔酶A具有特異性，負(fù)責(zé)將丙二酰基團(tuán)加載到KS結(jié)構(gòu)域下游的ACP上，為聚酮鏈的延伸提供必要的單元。GbnP的作用雖然尚不詳盡，但它可能參與聚酮鏈的加工或轉(zhuǎn)運(yùn)，與其他trans-AT酶協(xié)同作用確保聚酮鏈的正確加工和在細(xì)胞內(nèi)的適當(dāng)定位[65]。盡管gladiolinPKS存在20個(gè)KS結(jié)構(gòu)域，實(shí)際上從琥珀酰輔酶A起始單元和16個(gè)丙二酰輔酶A延伸單元組裝聚酮鏈的過(guò)程只需要17個(gè)鏈延伸反應(yīng)[61]。這意味著其中3個(gè)KS結(jié)構(gòu)域在這一過(guò)程中扮演了AT的角色，它們將聚酮鏈從一個(gè)ACP轉(zhuǎn)移到另一個(gè)ACP，而不是直接參與鏈的延伸。這種轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)在其他trans-AT型PKS途徑中通常由特定的KS0結(jié)構(gòu)域催化，這些KS0結(jié)構(gòu)域缺少催化鏈延伸所必需的HGTGT基序中的His殘基[5]。這種效率和多功能性的特點(diǎn)，為通過(guò)合成生物學(xué)和酶工程方法進(jìn)一步優(yōu)化和改造gladiolin的生物合成途徑提供了可能。通過(guò)精確調(diào)控KS的活性和選擇性，有望開(kāi)發(fā)出新型的抗生素。

Fig.4Chemical structures ofantibiotics synthesized byKS

圖4KS參與合成的抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖5Gladiolin（A）和etnangien（B）結(jié)構(gòu)的比較 Fig.5Comparison of the structure of gladiolin（A） and etnangien （B）

5KS結(jié)構(gòu)域的改造策略與應(yīng)用

聚酮化合物在組合生物合成中因其化學(xué)結(jié)構(gòu)的靈活性而受到重視。通過(guò)設(shè)計(jì)和重組PKS模塊，采用結(jié)構(gòu)域交換、模塊重組和基因突變等方法，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)創(chuàng)建新的合成路徑，從而促進(jìn)新型化學(xué)結(jié)構(gòu)化合物的產(chǎn)生，并提升產(chǎn)物的產(chǎn)量與純度，來(lái)開(kāi)發(fā)具有創(chuàng)新結(jié)構(gòu)和生物活性的新型聚酮化合物。

5.1 模塊交換

模塊交換策略基于PKS的模塊化特性，一個(gè)PKS系統(tǒng)特定的模塊與另一個(gè)PKS系統(tǒng)中的對(duì)應(yīng)模塊進(jìn)行替換，改變了PKS的底物選擇特異性、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和生物活性。Klaus等[67]將6-脫氧紅霉內(nèi)酯B合成酶（6-deoxyerythronolideBsynthase，DEBS）的PKS模塊3中的KS-AT-ACP結(jié)構(gòu)域的多肽連接區(qū)域的保守序列分別替換到DEBS的PKS模塊1、2和3，導(dǎo)致了底物選擇性的顯著變化，使得原本專門(mén)識(shí)別甲基丙二酰CoA的PKS系統(tǒng)能夠接受丙酰基CoA、甲基丙二酰基CoA以及丙二酰基CoA作為底物，使得PKS能夠合成出新的三酮內(nèi)酯衍生物。Sugimoto等[8]使用了金鏈菌素（aureothin）的AT-DH-KR-ACP-KS模塊，并在KS-AT連接肽的保守區(qū)域和ACP對(duì)接域之間進(jìn)行替換，改變了模塊間的相互作用，成功地合成了金鏈菌素的同系物。

5.2 定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變是通過(guò)在DNA序列上精確地操作特定堿基的插入、替換、刪除，來(lái)調(diào)整PKS的化學(xué)結(jié)構(gòu)，專門(mén)改變PKS中某個(gè)特定結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锏钠煤痛呋芰Γ蛘哂绊懖煌Y(jié)構(gòu)域之間的相互作用。Robbins等[69]對(duì)DEBS模塊1的KS結(jié)構(gòu)域HGTG序列中的關(guān)鍵活性位點(diǎn)殘基Cys或His替換為Ala，成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)KS結(jié)構(gòu)域活性的有意抑制。Koch等[7]通過(guò)識(shí)別PIKTE結(jié)構(gòu)域中的S148C活性位點(diǎn)并對(duì)其進(jìn)行突變，成功提高了KS對(duì)底物的適應(yīng)性，進(jìn)而合成了具有不同結(jié)構(gòu)的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。Murphy等[71]比較了Mycolactone聚酮合酶的KS與已知DEBS的KS3和AT3二域（EryKS3AT3）的晶體結(jié)構(gòu)，識(shí)別出可能影響KS結(jié)構(gòu)域底物結(jié)合口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基，對(duì)EryKS3的活性位點(diǎn)中的特定氨基酸進(jìn)行了精準(zhǔn)替換，評(píng)估了這些突變體對(duì)一系列替代硫酯底物的縮合反應(yīng)活性，表明盡管大多數(shù)突變體在催化特性上與原始酶相似，但當(dāng)Ala154被Trp替換后，該突變體（Ala154Trp） 顯著提升了對(duì)多種非天然底物的催化效率和作用范圍。

5.3前體指導(dǎo)下的新聚酮化合物的合成

前體指導(dǎo)合成策略是通過(guò)向培養(yǎng)系統(tǒng)中引入特定的前體分子，有效地引導(dǎo)PKS合成出結(jié)構(gòu)新穎的聚酮化合物。在這一過(guò)程中通過(guò)破壞PKS模塊1中的KS結(jié)構(gòu)域的活性，進(jìn)而利用外部添加適當(dāng)前體分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)PKS合成途徑的重新編程，從而合成出具有新生物活性的聚酮化合物[72]。Kinoshita等[72]利用KS失活的DEBS突變體（圖6），通過(guò)添加不同的非天然三酮前體，成功合成了一系列16元大環(huán)內(nèi)酯。這些研究不僅證實(shí)了KS對(duì)非天然底物的耐受性，還表明了KS在選擇性識(shí)別和處理底物方面的靈活性，擴(kuò)展了聚酮化合物的結(jié)構(gòu)和功能范圍。

Jacobsen等[73]通過(guò)在紅霉素合成途徑中引入一個(gè)遺傳阻斷使PKS模塊1中的KS結(jié)構(gòu)域失去活性，進(jìn)而使得DEBS無(wú)法正常合成6-脫氧紅霉素B（6-dEB）。而向這種阻斷突變體中添加了設(shè)計(jì)的合成分子，導(dǎo)致這些外源添加的分子能夠被高度選擇性地轉(zhuǎn)化為包括芳香性和環(huán)擴(kuò)張變體的非天然的聚酮化合物（圖7）。這種方法不僅為聚酮化合物的多樣性和復(fù)雜性提供了新的視角，也為進(jìn)一步探索和開(kāi)發(fā)新型生物活性物質(zhì)提供了強(qiáng)有力的工具。

6問(wèn)題與展望

KS作為PKS關(guān)鍵的催化組件，其結(jié)構(gòu)與功能對(duì)于理解聚酮化合物的生物合成機(jī)制至關(guān)重要。盡管近年來(lái)在KS的結(jié)構(gòu)、功能以及其在聚酮化合物生物合成中的應(yīng)用方面取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些挑戰(zhàn)和未來(lái)研究的潛在方向。雖然KS結(jié)構(gòu)域在不注：紅色框?yàn)榧t霉素DEBS中KS結(jié)構(gòu)域被失活。

圖6紅霉素全長(zhǎng)DEBS[72] Fig.6Erythromycin full-length DEBS[72]

圖7前體指導(dǎo)下的新聚酮化合物的合成[73] Fig.7Synthesis of new polyketides compounds guided by precursors[73]

同生物中具有高度保守性，但由于KS結(jié)構(gòu)域的多樣性和功能分化，在順式和反式AT型PKS中的不同作用機(jī)制，以及在混合NRPS/PKS體系中的功能串?dāng)_都是值得深入研究的領(lǐng)域。另外雖然通過(guò)結(jié)構(gòu)域交換、模塊重組和定點(diǎn)突變已經(jīng)能夠設(shè)計(jì)和構(gòu)建新的PKS系統(tǒng)，合成具有新穎結(jié)構(gòu)和生物活性的聚酮化合物，然而如何精確控制KS結(jié)構(gòu)域的底物選擇性和催化特性、如何優(yōu)化PKS系統(tǒng)的模塊化組裝及KS結(jié)構(gòu)域的工程化與應(yīng)用是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。此外KS結(jié)構(gòu)域在聚酮化合物生物合成中的精確作用和調(diào)控機(jī)制，尤其是在鏈長(zhǎng)確定、產(chǎn)品保真度和通路通量控制方面的作用，仍然是研究的前沿。因此了解這些機(jī)制不僅有助于揭示聚酮化合物生物合成的內(nèi)在規(guī)律，也為工業(yè)生產(chǎn)新型聚酮抗生素提供了理論基礎(chǔ)。隨著合成生物學(xué)和基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，KS結(jié)構(gòu)域的研究和應(yīng)用前景將更加廣闊。通過(guò)這些技術(shù)，研究者們有望在更深層次上理解和操縱KS結(jié)構(gòu)域，從而在聚酮化合物的生物合成中實(shí)現(xiàn)更高效和可持續(xù)性生產(chǎn)。

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