滇紫草與昆明滇紫草HPLC指紋圖譜的建立及對比研究

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007－8517（2025）15-0041-06

DOI： 10.3969/j .issn.1007-8517. 2025.15. zgmzmjyyzz202515009

Establishment and Comparative study of HPLC Fingerprint of Onosma paniculatum and Onosma kunmingense

YANGYimeiGUO Weiyi*LIU XiaojunPANG Shilong ZHANGYuyao Kunming Food and Drug Inspection Research Institute，Kunming 65OoOO，China

Abstract：ObjectiveEstablishtheHPLCfingerprintsofOnosmapaniculatumandOnosmakunmingense，andcomparethediferences between their fingerprints.Methods High performance liquid chromatography：TechMate PFP STV100A（ 4.6mm×250 mm ×5μm ）；mobile phase A is 0.2% formic acid，mobile phase B is acetonitrile，gradient elution，flow rate is 1.0mL/min ，column temperature 35‰ ，and the analytical wavelength is 516nm . The TCM chromatographic fingerprint similarity evaluation system（2004 edition）wasusedtoestablishthefingerprint mapsofOnosmapaniculatumandOnosma kunmingense，calculatethesimilarity，andidenifythecommonpeak withthereferenceproduct.Results TheHPLCfingerprintofOnosma paniculatumshowed8commonpeaks， amongwhich6wereidentified.TheHPLCfingerprintofOnosmakunmingensealsocontained8commonpeaks，with5of themidentified.ThesimilaritybetweenOnosmapaniculatumandOnosmakunmingensewaslow.ConclusionTherearediferencesintheHPLC fingerprintsbetweenOnosmapaniculatumandOnosmakumingense.Thismethodissimpleandhasgoodreproducibilityhichcanbe used for the quality evaluation of Onosma paniculatum and Onosma kunmingense.

Key words：Onosma paniculatum；Onosma kunmingense；HPLC；Fingerprint；Similarity

紫草是我國傳統中藥材 [1-2] ，含多種萘醌類化合物，此類化合物已被證實具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎等多種生物活性[3-4]?，F行《中國藥典》2020年版收錄的藥用紫草有兩種，分別為紫草科植物新疆紫草Arnebiaeuchroma（Royle）Johnst.或內蒙紫草ArnebiaguttataBunge的干燥根[5]。但紫草資源緊缺[6]，在云南地區習用滇紫草屬植物，本屬植物的根入藥[1-2]。滇紫草（Onosmapaniculatlm Bur.et.Franch.）和昆明滇紫草（O.cingutatumW.W.SmithetJ.E.Jeffrey）為滇紫草屬（Onos-ma）的兩個近緣品種，民間常將兩者混淆使用[2]。

目前滇紫草的研究主要有成分的分離鑒定[7-8]個別成分的含量測定[9-10]及藥效學研究[1]；昆明滇紫草的研究主要有生藥學研究及質量標準研究[13]，兩者化學成分的對比研究少見，有學者采用HPLC初步比較了兩者中乙酰紫草素的含量[14]，但中藥成分復雜，僅以單個指標作為評價中藥質量的依據較為片面。而指紋圖譜是一種宏觀的、可量化的技術手段，能反映出中藥整體的質量信息，包括化合物種類、數量及含量的高低，充分體現了中藥的整體性和復雜性，與單一指標成分的評價方法相比，更直觀，更科學，信息更豐富，不僅可用于鑒別中藥真偽，還可用于評價中藥質量的穩定性。

本研究采用HPLC建立滇紫草及昆明滇紫草的指紋圖譜，可客觀地反映其整體的化學特征，并通過兩者指紋圖的對比研究，分析兩者差異性成分，旨在為評價兩者內在質量提供參考。

1儀器、試藥及樣品

1.1儀器與試藥高效液相色譜儀（Agilent 1260，附紫外檢測器，美國安捷倫公司）。分析天平（百萬分之一，XPR26/A，梅特勒托利多公司），分析天平（萬分之一， MS304TS/02 ，梅特勒托利多公司），超聲波清洗儀（K5200DB，昆山市超聲儀器有限公司），超純水機（Milli-QIQ7015，默克公司）。左旋紫草素對照品（批號 110769-200506 ）、 β ， β^′- 二甲基丙烯酰阿卡寧對照品（含量 98.0% ，批號111689-201805）購自中國食品藥品檢定研究院，β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧對照品（含量 ?98% ，批號P05M7F14235）、去氧紫草素對照品（含量 98% ，批號G26D11L135846）、β－羥基異戊酰紫草素對照品（含量 ≥98% ，批號A101B211852）購自上海源葉生物科技有限公司，乙酰紫草素對照品（含量 ?98% ，批號DST220114-146）購自德思特生物技術有限公司。乙腈（批號F23N5N202，FisherChemical公司）、甲醇（批號F23NBF201，FisherChemical公司）、甲酸（批號2023041701，成都市科隆化學品有限公司）均為HPLC級別，純水為實驗室自制。

1.2樣品滇紫草10批次，購自不同生產企業，經本實驗室對照質量標準進行檢測，符合滇紫草OnosmapaniculatumBur.etFranch.的干燥根的特征。昆明滇紫草15批次，由項目組成員于昆明周邊采集，經昆明植分生物技術有限公司張君老師鑒定，為昆明滇紫草O.cingulatumW.W.smithetJ.E.Jeffrey的干燥根。25批樣品來源信息詳見表1。

2方法及結果

2.1色譜條件

安捷倫1260高效液相色譜儀（附紫外檢測器）；色譜柱為TechMatePFPSTV100A1 4.6mm×250mm ， 5μm ）；流速為 1mL/min ；檢測波長為 516nm ；柱溫為 35^qC ；進樣體積 20μL 5流動相A為 0.2% 甲酸，流動相B為乙腈，按表2進行梯度洗脫。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品貯備液配制分別精密稱取左旋紫草素、 β- 羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、β， β^′ -二甲基丙烯酰阿卡寧的對照品 1.871mg 、1. 672mg 、2.017mg 、 5.473mg 、 1.640mg 、 3.602mg ，置10mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對照品貯備溶液，于 0～8°C 保存備用。

表125批樣品來源信息表

表2梯度洗脫表

表2 （續）

2.2.2對照品溶液配制分別精密吸取“2.2.1”項下的對照品貯備液各 1.0mL ，用甲醇稀釋并定容至 10mL ，搖勻，用 0.22μm 濾膜過濾，即得。2.2.3供試品溶液制備取滇紫草與昆明滇紫草，于 60^°C 干燥 5h 后粉碎，過藥典4號篩，稱取滇紫草粉末約 1.0g （昆明滇紫草粉末約 2.0g ），置干燥的具塞錐形瓶中，精密加入甲醇 25mL ，稱定重量，冰浴超聲 30min ，放至室溫，用甲醇補足減失重量，搖勻，用 0.22μm 濾膜過濾過濾，即得。

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗取“2.2.3”項下的供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件，連續進樣檢測6次，記錄色譜圖及峰面積，結果測得各共有峰的相對保留時間RSD在 0.06%～0.08% 之間，相對峰面積RSD 在 1.1%～2.8% 之間，表明儀器穩定，精密度良好。

2.3.2重復性試驗取同一批次的滇紫草（編號為D1），按“2.2.3”項下的方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖及峰面積，結果測得各共有峰的相對保留時間RSD在 0.09%～0.45% 之間，相對峰面積RSD在 1.2%～3.0% 之間，表明該方法重復性好。

2.3.3穩定性試驗取滇紫草（編號為D1），按“2.2.3”項下的方法制備成供試品溶液，分別于0h、 2h 人 ⁴h 1 ⁶h 人 、 10h 、 12h 進樣，按“2.1”項下的色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖及峰面積，結果各共有峰的相對保留時間RSD在0.08%～1.1% 之間，相對保留峰面積RSD在1.5%～3.0% 之間，表明溶液在 ^12h 內較穩定。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1滇紫草指紋圖譜的建立取滇紫草10 批次，按“2.2.3”項下的方法操作，制備成10份滇紫草供試品溶液，另取“2.2.2”項下的對照品溶液，分別進樣 20μL ，記錄色譜圖。將所得的10批次滇紫草供試品溶液色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版）”軟件，設置以編號為“D1”的滇紫草供試品溶液色譜圖為參照圖譜，時間窗設置參數為 0.1min ，進行多點校正及Mark峰匹配，以平均值法生成滇紫草對照指紋圖譜如圖1，疊加圖譜如圖2。根據匹配結果顯示，有8個共有峰，經與對照品溶液比對，可指認其中6個共有峰，其中1號、2號、3號、5號、6號、8號色譜峰分別為左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧、去氧紫草素、 β ，β-二甲基丙烯酰阿卡寧。

圖1滇紫草對照指紋圖譜

圖210批次滇紫草疊加圖譜

2.4.2昆明滇紫草指紋圖譜的建立取15批次昆明滇紫草，按“2.2.3”項下的方法分別制備成15份昆明滇紫草供試品溶液，同“2.4.1”項下的方法建立昆明滇紫草指紋圖譜，其中設置以編號為“S10”的昆明滇紫草供試品溶液色譜圖為參照圖譜，生成的昆明滇紫草對照指紋圖譜如圖3，疊加圖譜如圖4。根據匹配結果顯示，有8個共有峰，經與對照品溶液比對，可指認其中5個共有峰，其中1號、2號、3號、6號、8號色譜峰分別為左旋紫草素、β-羥基異戊酰紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、β，β-二甲基丙烯酰阿卡寧。

圖3昆明滇紫草對照指紋圖譜

圖415批次昆明滇紫草疊加圖譜

2.4.3指紋圖譜比較分析將滇紫草對照指紋圖譜與昆明滇紫草對照指紋圖譜進行比較（如圖5），結果顯示，1～3號及6～9號峰為滇紫草與昆明滇紫草所共有，但各色譜峰峰高及響應強度不同，滇紫草色譜圖中，成分含量較高且響應較好的為5號峰（β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧），而昆明滇紫草色譜圖中，成分含量較高且響應較好的為3號峰（乙酰紫草素）及9號峰。而4號峰與5號峰為兩者主要差異性成分，滇紫草中無4號峰，昆明滇紫草中無5號峰，表明兩者的指紋圖譜存在顯著差異。

2.5相似度分析將25批次樣品數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004版）”軟件，生成25批樣品共有模式圖譜，并以共有模式圖譜為參照，進行自動匹配，計算相似度，詳見表3。根據相似度及匹配結果顯示，滇紫草與共有模式圖譜的相似度低，均 lt;0.550 ；昆明滇紫草與共有模式相似度在 0.759～0.958 間，相似度略高，兩者與共有模式的相似度一低一高，從側面反映了兩者是存在差異的。同時，滇紫草與昆明滇紫草間的相似度較低，在 0.280～0.490 之間，也較直觀地說明了兩者存在較大差異。雖然不同品種樣品間的相似度低，但相同品種樣品間相似度高，其中 D1～D10 為滇紫草，彼此間相似度 gt;0.970 ：S1～S15 為昆明滇紫草，除S6、S10、S14外，其余樣品間相似度 gt;0.934 ，而S6、S10、S14各成分色譜峰較其他批次樣品的響應高很多，因此與其他昆明滇紫草的相似度低，在 0.525～0.885 之間，但三者之間相似度在0.915以上。

圖5滇紫草指紋圖譜與昆明滇紫草指紋圖譜對比圖

注：S1為滇紫草對照指紋圖譜，S2為昆明滇紫草對照指紋圖譜，峰1為左旋紫草素，峰2為 β- 羥基異戊酰紫草素，峰3為乙酰紫草素，峰5為β-乙酰氧基異戊酰阿卡寧，峰6去氧紫草素，峰8為 β ，β-二甲基丙烯酰紫草素。

表325批樣品相似度評價結果表

表3 （續）

2.6共有峰的相對保留時間及峰面積從色譜圖來看，滇紫草和昆明滇紫草中均含有乙酰紫草素，且乙酰紫草素色譜峰分離度較好，響應良好，故選擇乙酰紫草素色譜峰作為參照峰（S），計算共有峰的相對保留時間，詳見表4。共有峰的保留時間波動較小， RSDlt;0.2% 。滇紫草共有峰的峰面積的RSD在 21.87%～40.65% 之間，昆明滇紫草共有峰峰面積的RSD在 69.20%～170.90% 之間（詳見表5），說明兩紫草中各成分的含量存在差異，特別是昆明滇紫草中各成分的含量差異較大，原因可能為本研究的昆明滇紫草為野外采集，其質量多受地理環境、自然因素等影響有關。

表4滇紫草及昆明滇紫草相對保留時間計算結果表

表5共有峰的峰面積測定結果表

2.7聚類分析以25批樣品的共有峰峰面積為變量，采用SPSSPRO軟件進行聚類分析，結果如圖6。根據圖6結果顯示，25批樣品根據其不同品種的基原進行聚類，其中D1～D10 聚為1類，為滇紫草樣品， S1～S15 聚為1類，為昆明滇紫草樣品，此結果與相似度分析結果基本一致。

圖625批樣品的聚類樹狀圖

2.8主成分分析以25批樣品共有峰的峰面積為變量，設置主成分個數為3，利用SPSSPRO軟件進行主成分分析（PCA），結果顯示KMO的值為0.641，Bartlett球形檢驗 Plt;0.05 ，說明各成分間具有相關性。前3個成分的方差貢獻率分別為60.748% 、 24.099% 、 8.417% ，累積方差貢獻率達 93.264% ，表明前3個成分可反映兩者大部分的差異信息。因子載荷系數表見表6，在主成分1中，1號峰、3號峰、6號峰、8號峰及9號峰的載荷較大（載荷系數 gt;0.85 ），且呈正相關；主成分2主要由2號峰和5號峰主導，且系數一正一負（2號峰為-0.740，5號峰為0.841），表明2號峰與5號峰呈現負相關性；主成分3的載荷系數均較小。由此可見，不同成分對滇紫草和昆明滇紫草質量的權重是有區別的。根據主成分分析結果，構建主成分分析得分圖，如圖7所示。由圖7可知，滇紫草（ D1～D10 ）主要分布于得分圖的左上側，且較集中地聚在一起；昆明滇紫草（S1～S15）除S6、S10、S14外，其余主要分布在得分圖的左下側，分布相對分散，此結果與相似度結果及聚類分析結果基本一致。

表6因子載荷系數表

圖7主成分分析得分圖

3討論

查閱文獻及中國藥典發現，多數學者采用等度洗脫的方法對紫草中的多種萘醌類成分進行檢測，但本實驗研究過程中，在采用等度洗脫的方法時，昆明滇紫草的色譜峰分離效果不好，其2號峰附近會有干擾峰，分離度不好。在參考郝鶴等[15]的梯度洗脫方法基礎上，本研究對其方法進行優化并建立了梯度洗脫的方法，可將各色譜峰較好分離。

研究結果顯示，本研究建立的方法穩定，重復性好，可同時用于滇紫草和昆明滇紫草指紋圖譜的建立，并通過兩者指紋圖譜的比較，可將兩者進行很好的鑒別區分，對其內在質量評價及鑒別具有參考意義。

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