GC法測定小兒肺熱咳喘口服液中甜蜜素的含量

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】A 【文章編號】1007-8517（2025）15-0047-05

DOI： 10.3969/j . issn.1007-8517.2025.15. zgmzmjyzz202515010

Determination of Sodium Cyclamate in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution by Gas Chromatography

YANG Changxiao' ZHOU Qin2

1.Instituteof Physicochemical Inspection，Sichuan Center forDisease ControlandPrevention，Chengdu 61O041，China; 2.Physicochemical Laboratory，Ganzi Tibetan Autonomous Prefecture Center for Disease Control and Prevention，Kangding 626OoO，China

Abstract：ObjectiveToestablishagaschromatographymethodforthedeterminationofsodiumcyclamateinXiaoerFeire Kech uanOral Solution.MethodsSodiumcyclamate inthetestsamplereactedwithsodiumnitriteinanacidicmedium，producingcyclohexanol nitriteand cyclohexanol；folowing extraction with n-heptane，the derivatives were separatedusing a DB ^-17 capillary column （30m×0.32mm×0.25μm） ）and detected using a hydrogen flame ionization detector（FID）.The analyte wasqualified by retention time and quantified by external standard curve method. Results Within the concentration range of 5～500μg/m L，good linearity was exhibited between the concentration of sodium cyclamate and the sum of peak areas of the derivatives （ r=0.9999 ）．The average spiked recovery was 100.8% （ RSD=2.9% ， n=6 ）.The content of sodium cyclamate in three batches of samples was approximately （204號 5.00g/L ，complying withthe manufacturing processin ChinesePharmacopoeia.Conclusion With strong specificity，goodprecision andhighacuracy，thismethodissuitableforthedeterminationofsodiumcyclamate inXiaoerFeireKechuanOral Solution.

Keywords： Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution；Sodium Cyclamate；Gas Chromatography

甜蜜素化學名稱為環己基氨基磺酸鈉（ C₆H₁₂ NO₃SNa ），在我國批準作為食品添加劑使用。其甜度為蔗糖的 30～50 倍，也被作為矯味劑應用于多種兒科中成藥中以改善口感，從而提高用藥依從性。小兒肺熱咳喘口服液收載于2020版《中國藥典》一部，具有清熱解毒、宣肺化痰等功效[，是兒科常用的中成藥之一。該中成藥配方由麻黃、苦杏仁、石膏、甘草等十一味中藥組成，輔料包括苯甲酸鈉、甜蜜素等。兒童處于生長發育階段，生理上較為脆弱，過量攝入甜蜜素可能會對肝臟、神經系統造成損害，影響骨骼發育2]。為確保小兒肺熱咳喘口服液的安全性，推進質量標準的現代化和國際化進程，有必要對其中甜蜜素的含量進行測定和控制。

目前文獻報道的甜蜜素的測定方法主要包括氣相色譜法（GC）[3-4]、高效液相色譜法（HPLC）[5-6]、離子色譜法（IC）[7]、氣相色譜－質譜法（GC-MS）[8]、超高效液相色譜－串聯質譜法（UPLC-MS/MS）[9等，但主要應用于白酒、飲料、蜜餞等食品樣品，而針對中成藥中甜蜜素含量的測定鮮有報告。本研究建立了氣相色譜法對小兒肺熱咳喘口服液中的甜蜜素含量進行測定，并對樣品前處理操作和色譜條件進行了優化。方法學驗證結果顯示該方法靈敏度、準確度和重現性高。

1材料

1.1儀器 GC-7890B氣相色譜儀（AgilentTechnologies，美國）配氫火焰離子化檢測器（FID），十萬分之一電子天平（SartoriusWeighingTechnologyGmbH，德國），H2100R高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），MultiRe-ax渦旋振蕩器（heidolph，德國），KS-7200DE液晶超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司），Milli-Q超純水機（MerckMillipore，美國）。1.2材料環己基氨基磺酸鈉（甜蜜素）標準物質（純度 99.9% ，上海安譜璀世標準技術服務公司）；環己烷、正己烷、正庚烷（Fisher，美國）均為色譜純；亞硝酸鈉、硫酸（重慶川東化工（集團）有限公司）均為分析純。實驗用水為超純水。小兒肺熱咳喘口服液（批號：202311095、202312086、202211118）購自本地藥房。

2方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1亞硝酸鈉溶液稱取 s_g 亞硝酸鈉，用超純水溶解并稀釋至 100mL ，混勻。

2.1.2硫酸溶液量取 108mL 硫酸，緩慢加人800mL 水中并不斷攪拌，冷卻后加水稀釋至1000mL，混勻。

2.1.3水中環己基氨基磺酸鈉標準溶液準確稱取 500mg （精確至 0.1mg ）環己基氨基磺酸鈉標準物質于 100mL 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻。

2.1.4環己基氨基磺酸鈉標準中間液準確吸取環己基氨基磺酸鈉標準儲備液 10mL 于 50mL 容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻。

2.1.5供試品溶液準確吸取 5mL 試樣于 50mL 容量瓶中，加超純水稀釋并定容至刻度。準確吸取 2mL 所得溶液于 50mL 塑料離心管中，加超純水至 20mL ，渦旋 5min ，超聲提取 10min ，混勻后放至室溫備用。將裝有試樣提取液的離心管置于冰浴 10min 后，依次加入 5mL 亞硝酸鈉溶液（ 50g/L） ）、 5mL 硫酸溶液（ 200g/L ）和 10mL 正庚烷，混勻，于冰浴中放置 30min ，期間振搖10次，取出后加入 2.5g 氯化鈉，渦旋 3min ，于 4% （204號條件下 9000r/min 離心 3min ，取上清液過0.22（204 μm 有機相微孔濾膜，供上機測定。

2.1.6標準系列工作溶液分別準確移取（20 0.05mL 、 0.10mL 、 0.25mL 、 0.50mL 、1.00mL 1 2.5mL 7 5，00mL 環己基氨基磺酸鈉標準中間液（ 1000μg/mL ）于 50mL 塑料離心管中，用水稀釋至 20mL ，后續步驟按供試品溶液制備描述自“渦旋 5min ”操作。所得溶液中待測物的濃度分別為 5μg/mL 、 10μg/mL 、 、 50μg/ mL、 100μg/mL 、 250μg/mL N 500μg/mL 。

2.1.7陰性對照溶液按小兒肺熱咳喘口服液處方及工藝，制備不含甜蜜素的陰性樣品，并按照供試品溶液的制備步驟制備陰性對照溶液。

2.2色譜條件色譜柱：DB－17毛細管柱（ 30m×0.32mm×0.25μm） ；柱溫升溫程序：初溫 50^qC 保持 3min ， 10°C/min 升溫至 70% 保持1min ， 30^qC/min 升溫至 220^qC 保持 3min ；進樣口溫度： 230^qC ；進樣量： 1μL ；進樣方式：分流進樣，分流比為 1：10 ；檢測器（FID）溫度：260^°C ；載氣：高純氮氣（純度 ?99.999% ），流速為 1.5mL/min ；氫氣流速： 32mL/min ；空氣流速： 300mL/min 。

2.3專屬性試驗分別精密吸取陰性對照溶液、標準曲線系列工作溶液和供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析，并記錄色譜圖。結果顯示，甜蜜素兩個衍生產物的色譜峰均達到基線分離，陰性對照溶液在待測組分相應位置無干擾。典型譜圖如圖1所示。

2.4線性、檢測限及定量限分別精密吸取2.1項下經衍生化處理的標準系列工作液注入氣相色譜儀中，按2.2項下色譜條件進樣分析。以標準系列工作溶液中環己基氨基磺酸鈉的濃度為橫坐標，以兩衍生產物峰面積之和為縱坐標，繪制標準曲線。在 5～500μg/mL 的濃度范圍內，回歸方程為y=0.6689x+5.4124 ，相關系數（r）為0.9999。取 5mL 陰性對照樣品，加人環己基氨基磺酸鈉標準制備成含量為 5.03g/L 的加標樣品，按照供試品溶液制備步驟操作制備測試液，按2.2項下色譜條件進樣分析，計算目標物在色譜圖中的信噪比（S/N）。以 S/n=3 和 S/n=10 時樣品中甜蜜素的含量分別作為方法的檢測限和定量限。結果顯示，方法的檢測限和定量限分別為 0.01g/L 和0.03g/L （204號

注：A.陰性對照溶液；B. 100μg/mL 標準溶液；C.供試品溶液；1環已醇亞硝酸酯；2環已醇

圖1典型色譜圖

2.5重復性試驗取 5mL 試樣（批號：202311095）6份，按照2.1項下步驟制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣分析。結果顯示，6份試樣中甜蜜素含量水平分別為 5.01g/L 、5.03g/L ： 4.97g/L 7 5.05g/L 、 4.96g/L 一 5.00g/L 平均值為 5.00g/L ，相對標準偏差（RSD）為0.7% ，表明該方法的重復性良好。

2.6準確度試驗取6份 2.5mL 試樣（批號：202311095）于 50mL 容量瓶中，分別加入約12.5mg環己基氨基磺酸鈉標準物質，按照2.1項下供試品溶液制備步驟制備準確度試驗溶液，并按2.2項下色譜條件進樣分析，計算回收率。甜蜜素的回收率為 96.7%～ 105.7% ，平均回收率為100.8% ，相對標準偏差（RSD）為 2.9% ，表明該方法準確度高。

2.7精密度試驗取標準工作溶液（ 100μg/ mL），經衍生處理后，按2.2項下色譜條件，重復進樣6次，測定峰面積。兩衍生產物的峰面積之和RSD為 0.05% （ n=6 ），表明儀器的精密度良好。2.8穩定性試驗取 5mL 試樣（批號：202311095），按照2.1項下步驟制備供試品溶液。供試品溶液在室溫條件下，分別于 ）h，1h，2h 、^3h 、 、 8h 進樣測定，考察衍生產物的峰面積響應隨時間的變化。結果如圖2所示。

表1準確度試驗結果表

圖2衍生產物的峰面積響應隨時間變化圖

從圖2可知，甜蜜素兩個衍生產物的峰面積隨時間延長呈現相反的變化趨勢，但 ³h 內峰面積之和基本保持恒定； ³h 以后峰面積之和顯著下降。因此衍生后測試液需要盡快進行分析。

2.9實際樣品的測定采用本研究建立的方法對本地藥房購買的三批次小兒肺熱咳喘口服液中甜蜜素的含量進行測定。結果見表2。

測定數據顯示，小兒肺熱咳喘口服液中甜蜜素含量符合2020年版《中國藥典》制法中的添加水平，并且不同批次、不同包裝規格產品之間甜蜜素含量較為一致，說明生產廠家對產品中甜蜜素含量進行了嚴格的控制。

表2實際樣品測定結果表

3討論

3.1定性與定量依據甜蜜素是環己基氨基磺酸的鈉鹽形式，也存在鈣鹽變體，無法直接用氣相色譜法測定，但其在酸性條件下可與亞硝酸鈉反應生成環己醇，環己醇在酸性條件下又可與亞硝酸鈉發生酯化反應生成環己醇亞硝酸酯。因酯化反應呈現一種動態平衡的狀態，所以提取液中會同時存在環己醇。穩定性研究顯示隨著放置時間的延長，環己醇亞硝酸酯的峰面積會變小，環己醇的峰面積會增大，對二者分別進行濃度-峰面積線性回歸結果顯示線性較差，但因火焰離子化檢測器（FID）對含雜原子的烴類有機物中的同系物（碳數 ?3 ）的相對響應值幾乎相等，而環己醇亞硝酸酯和環己醇分子式中均含有6個碳原子，且二者之間轉化比例為1：1，保留時間也比較接近，所以其峰面積之和基本保持恒定[10]，因此依據環己醇亞硝酸酯和環己醇的保留時間對甜蜜素進行定性，依據二者峰面積之和進行定量。

3.2提取溶劑的選擇有研究比較了正己烷、正庚烷和環己烷作為提取溶劑時的色譜圖，認為正己烷是測定甜蜜素的理想提取溶劑[1]。本研究分別采用環己烷、正已烷和正庚烷作為提取溶劑對同一樣品同法處理后進樣，結果發現使用正己烷和正庚烷提取時衍生產物的峰面積之和接近，并顯著低于使用環己烷作為提取溶劑時衍生產物的峰面積之和。

在此基礎上開展空白試驗對3種溶劑進行比較發現，使用正己烷作為提取溶劑時環己醇的色譜峰之后緊鄰兩個較大雜峰，在測定條件稍有變化時可能會干擾甜蜜素的測定；使用環己烷作為提取溶劑時環己醇亞硝酸酯的保留時間處會出現干擾峰，會導致實際樣品測定結果偏高，這與采用實際樣品所得考察結果一致。使用正庚烷作為提取溶劑時目標峰處及附近均無其它雜峰；另外，正庚烷沸點相對較高，在衍生和提取操作過程中揮發損失導致的溶劑體積變化較小。雖然有報道[12]顯示正庚烷作為萃取溶劑時會影響進樣針的使用壽命，但從保證測定結果的準確性的角度考慮，本研究選擇正庚烷作為提取溶劑。

3.3 衍生條件的優化

3.3.1試劑加入順序的確定衍生反應中涉及的試劑和提取溶劑的加人順序可能對反應結果產生較大的影響。本研究通過向陰性對照樣品中加標制備甜蜜素含量為 5.03g/L 的加標樣品，并采用以下不同試劑加人順序進行處理，比較甜蜜素測定的回收率和精密度：（A）依次加入正庚烷、亞硝酸鈉和硫酸進行衍生和提取；（B）依次加入亞硝酸鈉、硫酸和正庚烷進行衍生和提取；（C）先依次加入亞硝酸鈉和硫酸進行衍生，衍生結束后然后加入正庚烷進行提取。結果顯示順序為B時回收率最高，精密度也最好，因而本研究選擇依次加入亞硝酸鈉、硫酸和正庚烷進行衍生和提取。3.3.2衍生溫度和時間的確定溫度對甜蜜素衍生產物的轉化率影響較大，對定量分析結果的影響較小[13]，但考慮到在硫酸存在的條件下，衍生反應過程中會釋放出大量的熱，本研究選擇在冰浴中進行衍生反應以保證反應的穩定性和安全性。

本研究考察了反應時間對衍生產物峰面積之和的影響，結果顯示，隨著反應時間的增加，衍生產物的峰面積之和呈現先增加后穩定的趨勢，在 30min 達到平臺，說明此時衍生反應已較為充分，因此設定反應時間為 30min 。

3.3.3酸度及振搖次數的確定甜蜜素和亞硝酸鈉的衍生化反應是在加入硫酸形成的酸性條件下進行的，酸度對衍生效果起決定性作用。與食品中甜蜜素測定實驗條件研究結果一致[14]，隨著酸度的增加，衍生產物的峰面積響應也不斷增加，當硫酸濃度超過 200g/L 時，衍生產物的峰面積響應緩慢下降。因此，本研究選用的硫酸溶液濃度為 200g/L 。振搖次數是影響衍生效果的重要因素之一。衍生期間振搖可以使甜蜜素與亞硝酸鈉更加充分接觸，從而促進衍生反應的完成。本研究中參考相關文獻報道，設定衍生過程中振搖10次[15] O

3.4色譜條件的優化文獻報道中多采用HP-5毛細管柱對衍生產物進行分離后測定[16]。本研究比較了 HP-5 （ 30m×0.32mm×0.25μm ）和DB-17 （ 30m×0.32mm×0.25μm ）毛細管柱的分離效果和靈敏度，發現衍生產物在兩根色譜柱上均可以達到基線分離，但采用DB-17毛細管柱時相同濃度的分析物峰面積響應顯著較高，因此選用DB-17毛細管柱作為測定用色譜柱。比較了不分流進樣、分流進樣（分流比為1：5和1：10）時的色譜效果，發現不分流進樣和1：5分流進樣時目標峰附近雜峰的響應也較高，可能會干擾測定，而采用1：10分流進樣時目標峰附近雜峰響應基本等同于噪聲，潛在干擾可忽略。對載氣流量、升溫程序等其它條件也進行了優化，盡量縮短色譜運行時間，實現快速、靈敏、準確分析。

綜上，本研究建立了氣相色譜法測定小兒肺熱咳喘口服液中甜蜜素的含量，并對樣品前處理操作和色譜分析條件進行了優化，方法學驗證結果顯示優化后的方法線性范圍寬、準確度高、精密度好，可用于小兒肺熱咳喘口服液中甜蜜素含量的測定和控制。

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（收稿日期：2024-11-01 編輯：陶希睿）