基于蛋白組學和結構分析的絲綢自然老化機理研究

關鍵詞：絲織品；自然老化；老化機理；蛋白組學；結構分析；二級結構

中圖分類號：TS101.92 文獻標志碼：A 文章編號：1001-7003（2025）08-0042-07

DOI：10.3969/j.issn.1001-7003.2025.08.005

古代絲綢作為中國文化的重要組成部分，具有豐富的歷史價值和文化意義[1]。絲綢文物承載著中國古代絲綢產業的輝煌歷史，它們記錄了絲綢的起源、發展和創新。通過研究絲綢文物，可以了解到中國古代絲綢業的繁榮和技術的傳承[2]。絲綢文物還承載著豐富的文化意義，它們體現了古代中國人民對美的追求；絲綢的精美紋樣和色彩豐富的圖案，反映了中國文化的豐富內涵和獨特風格。

然而，絲綢文物極易受到外源性因素的影響而被破壞[3-5]，深入研究蠶絲纖維的老化過程對于制定有效的絲綢文物預防性保護策略至關重要[6]。由于蠶絲是一種天然的蛋白質纖維，絲綢文物的老化降解也可以看作是絲素蛋白的老化降解[7]。該動物蛋白具有復雜的多級結構，每一級結構的改變都會影響到整體的結構，進而改變絲綢的形貌和結構，導致絲綢文物的老化降解[8-10]。隨著時間的推移和自然環境的改變，絲綢文物非常容易受到物理、化學和生物因素的影響，目前大多數研究都集中在單因素影響下絲素蛋白的降解機理上[11-12]

絲綢老化機理的研究離不開先進、有效的分析檢測技術[13-15]。蠶絲是一種蛋白質纖維，近年來生物學中常用的一些分析方法被引人到了絲織品的研究中[16]。Pan等[17]利用蛋白組學和代謝組學相結合的方法研究了兩種不同的細菌對絲綢的影響，結果表明銅綠假單胞菌對輕鏈等結構松散蛋白的降解更集中，而嗜麥芽窄食單胞菌對重鏈、輕鏈和P25蛋白的作用更均勻。Wang等[18]利用蛋白組學和免疫學技術，分析了不同種屬的現代蠶絲，篩選出特征肽段，建立了一種新型蠶絲種屬鑒定方法。Guo等[9]利用蛋白組學對桑蠶絲的成分進行分析，鑒定出了129個蛋白質，其中30個被注釋為蛋白酶抑制劑，這解釋了桑蠶繭具有抗菌性的原因。上述先進技術為深入理解絲綢老化機理提供了新視角。

為了揭示絲織品在自然條件下的老化機理，本文將絲綢埋藏在海洋沉積物中，模擬絲綢文物的自然老化過程，以獲得絲綢文物的人工模擬樣品。然后通過掃描電子顯微鏡和傅里葉紅外光譜分析了絲纖維的微觀形貌及絲素蛋白二級結構的變化，進一步運用蛋白組學技術從蛋白分子水平研究絲綢自然老化機理。該研究有望進一步推進對絲綢老化機理的探索。

1實驗

1.1 原料和試劑

平方米質量為 82g/m² 的平紋織物（柞蠶絲，挪威科技大學），分析純氯化鈣（ CaCl₂ ，上海麥克林生化科技有限公司），?99.5% 乙醇（ C₂H₅OH ，杭州高晶精細化工有限公司），色譜級胰蛋白酶（Trypsin，普洛麥格（北京）生物技術有限公司），分析純碳酸氫銨（ NH₄HCO₃ ，美國Sigma-Aldric），色譜級乙睛（ CH₃CN ，美國Sigma-Aldrich），分析純十二烷基硫酸鈉（SDS，美國Bio-RadLaboratories），分析純三（羥甲基）氨基甲烷鹽酸鹽（ C₄H₁₁NO₃ .HCI，美國Bio-RadLaboratories），分析純二硫蘇糖醇（DTT，美國Bio-RadLaboratories），分析純尿素（ CH₄N₂O ，美國Bio-RadLaboratories）， 99% 甲酸（HCOOH，美國ThermoFisherScientific），去離子水（自制）。

1.2設備

FA2104電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司），FD-IA-50真空冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（杭州儀器制造有限公司），TF-86-30LA超低溫冰箱（上海拓紛機械設備有限公司），5430R離心機（德國Eppendorf），JSM5610LV場發射掃描電子顯微鏡（日本電子JEOS），Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克有限公司），GenPure純水儀（美國ThermoFisherScientific公司），Q-ExactiveHF-X質譜儀（美國ThermoFisherScientific公司），Easy-nLC12O0色譜系統（美國ThermoFisherScientific公司），NikonD51OO數碼單反相機（日本尼康株式會社）。

1.3方法

1.3.1老化樣品的制備

自然老化實驗在瑞典西部海岸馬斯特蘭德港進行[20]該港口毗鄰斯卡格拉克海峽，冬季海水溫度 3～7‰ ，夏季達10% 以上；受大西洋暖流影響，冬季溫暖濕潤，不封凍，同時有來自波羅的海的鹽度較小的海流從表層流向北海；海洋生態狀況良好，生物多樣性復雜；埋藏處水深 15m 。分別將樣品放入覆蓋和未覆蓋無紡土工布的尼龍網中，每個尼龍網用尼龍繩并排系在穿孔塑料托盤的底部，每個埋藏期準備一個托盤，將托盤埋在 50cm 深的海洋沉積物中（沉積物的pH值為7.2，含有的主要菌群為德爾塔變形菌、酸性菌、扁孢霉菌和放線菌），覆蓋有無紡土工布保護層的尼龍網中的樣品分別埋藏1、2、3、7年后獲得老化樣品1Cover、2Cover、3Cover、7Cover，未覆蓋無紡土工布保護層的尼龍網中的樣品分別埋藏1、2、3、7年后獲得老化樣品1Uncover、2Uncover ?³ Uncover、7 Uncover，未處理的絲織品作為空白對照。

1.3.2 絲素蛋白的提取

稱取 6.6g 氫氧化銅粉末，加入 50mL 的去離子水，緩慢攪拌使其充分溶解，加入 8.5mL 乙二胺，攪拌均勻，充分反應后，加入去離子水并使用 100mL 容量瓶定容，制得銅乙二胺溶液（CED）。分別稱取 5mg 的絲綢對照樣品和老化樣品，按照1：50的浴比將絲綢樣品加到提取液中， 60‰ 水浴中緩慢攪拌至完全溶解。絲素蛋白提取完全后，冷卻至室溫，隨后使用醋酸溶液（質量分數為 10% ）調節絲素蛋白溶液的pH值至8.5，使用磁力攪拌器攪拌溶液以防止絲素蛋白凝結。將絲素蛋白溶液倒入截留相對分子質量為 3500KDa 的透析袋中，用去離子水在 4‰ 下透析 ^72h 。透析完成后將絲素蛋白溶液置于超低溫冰箱中 -80C 冷凍 ^4h ，隨后使用真空冷凍干燥機進行冷凍干燥處理，得到絲素蛋白粉末。

1.3.2 絲素蛋白的酶解

取 100μg 樣品加人 100μL 蛋白提取（SDT）裂解液（ 4% SDS，100mMTris-HCI）中，然后加入 100μL 二硫蘇糖醇（1M），沸水浴 5min ，冷卻至室溫，離心取上清。在上清液中加人 200μL UAbuffer（8MUrea， 150mM Tris-HCl， pH8.0 ））混合均勻，將混合均勻后的溶液轉人至 10KD 超濾離心管中離心 15min ，轉速設置為 12000g ，棄上清。加入 10μL50mM IAA溶液， 600r/min 振蕩 1min 。室溫避光 30min 后加入100μL UAbuffer， 12 000g 離心 10min ，重復2次。加人100μL NH₄HCO₃ buffer， 14000g 離心 10min ，重復2次。加人 40μL Trypsin buffer（ 6μg Trypsin 溶于 40μLNH₄HCO₃ 水溶液）， 600r/min 振蕩 酶解 16～18h 轉移至新收集管， 12 000g 離心 10min ，去除沉淀物。使用C18StageTip對酶解后的肽段進行脫鹽處理，去除絲素蛋白提取液中的鹽離子，肽段真空干燥后加入 0.1% FA溶液，OD280測定肽段濃度確定其符合測試標準，以備下一步LC-MS分析使用。

1.4測試與表征

1.4.1 表面形貌測試

數碼照片：分別取絲綢對照及老化樣品，置于攝影棚內，相同光源下使用NikonD5100數碼單反相機拍攝數碼照片，觀察絲綢對照樣及老化樣顏色變化，評價絲綢樣品老化程度。

掃描電子顯微鏡照片：將絲綢對照及老化樣品分別剪裁為 3mm×3mm 的小方塊，在樣平臺上粘貼導電膠帶，隨后將待測樣品粘貼在導電膠帶上，噴金 180s ，使用JSM5610LV場發射掃描電子顯微鏡對老化前后的絲綢樣品進行表面形貌觀察，拍攝放大100倍的樣品微表面照片，通過ImageJ軟件計算被破壞/侵蝕區域的面積占比。

1.4.2傅里葉變換紅外光譜測試

采用Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀分別對絲綢對照及老化樣品進行測試，使用纖維切片器將待測的絲綢樣品處理成粉末狀，隨后使用KBr進行壓片制樣，光譜采集在 4000～ 500cm^-1 。使用Origin軟件對蛋白酰胺I區進行分峰擬合處理，以二階導數確定出峰位置，計算絲素蛋白中不同二級結構的相對含量。為提高分析的準確性和可靠性，每組數據取5個平行樣，求取相對含量的平均值和標準偏差。

1.4.3液相色譜質譜連用蛋白分析

使用納升流速EasynLC1200色譜系統對酶解后的肽段進行色譜分離。用 0.1% 甲酸水溶液（緩沖液A液）平衡色譜柱，將樣品放入補集柱（ 100μm×20mm，5μm，C18，Dt MaischGmbH），隨后進入色譜分析柱（ 75μm×150mm，3μm，C18 Dr.MaischGmbH）進行梯度分離處理，流速為 300nL/min 緩沖液B液（ 0.1% 甲酸、 80% 乙腈和水混合溶液）線性梯度為 0～2min，2%～5%;2～44min，5%～28% 44～51min 28%～40% ： 51～53min = 40%～100% 5 53～60min ，維持在100% 。肽段分離后進行DDA（數據依賴采集）質譜分析。分析時長為 60min ，檢測模式為正離子，母離子掃描范圍為350～1800m/z ，一級質譜分辨率：60000 ， AGCtarget為3e6，一級MaximumIT為 50ms 。二級質譜分辨率為15000 ，AGCtarget為1e5，二級MaximumIT為50ms ，MS2Activation Type 為 HCD，Isolation window為1.6m/z ，Normalized collisionenergy為28。

采用Uniprotd蛋白數據庫（https：//www.UniProt.org/）中的Antheraeapernyi（Bombyxpernyi）蛋白數據庫對數據進行搜庫處理。質譜數據庫檢索軟件為MaxQuant2.0.1.0。MaxQuant搜庫軟件分析參數設置如下：肽的最大修飾數為6，第一次搜索母離子質量容差為 20ppm ，主搜索母離子質量容差為 4.5ppm ，二級碎片離子的質量容差為 20ppm ，固定修飾為半胱氨酸氨基甲基烷基化，可變修飾為甲硫氨酸氧化及蛋白N端乙酰化，蛋白鑒定和PSM鑒定的FDR為0.01。

2 結果與分析

2.1 表面形貌分析

為了探究絲織品老化前后的形貌變化，本文分別用數碼單反相機和場發射掃描電子顯微鏡對老化前后的絲綢進行了形貌觀測。圖1為絲織品老化前后的數碼照片，可見未經處理的絲綢是淡黃色的，表面比較光滑，并伴有一定的光澤感；經過不同時間的埋藏之后絲織品的顏色變成了褐色，表面變得暗淡、粗糙，失去了絲綢光滑、細膩的特性。其中，表面未覆蓋保護層的絲綢老化情況較為嚴重，老化3年的絲綢表面甚至出現了肉眼可見的微孔，手感極為粗糙，表面毫無光澤感；老化7年的絲綢降解程度最高，已不具備一般紡織品的力學性能，幾乎觸之即碎。絲素蛋白的結晶區是提供絲綢力學性能的主要部分，因此推測未覆蓋保護層的老化7年的絲織品結晶區遭到了嚴重的破壞，導致其力學性能基本喪失[21]。

圖2為絲織品老化前后的掃描電鏡照片，可見未經老化的絲綢對照樣表面整體呈現一種比較光滑平整的狀態。隨著埋藏時間的延長，絲纖維表面的損傷程度愈加嚴重。當表面覆蓋有保護層的絲織品在海洋沉積物中埋藏1年時，絲纖維表面出現了輕微的微原纖維和細纖維脫落現象，纖維表面的光滑度同樣受到了影響；埋藏2年的絲織品表面由光滑變得毛糙；分別埋藏3年和7年的絲織品表面都出現了大量微原纖維和細纖維脫落的現象，被破壞/侵蝕區域的面積占比分別達到 44%±7% 和 65%±11% （表1）。不同于埋藏前期的是，在埋藏3年和7年的絲織品表面可以觀察到孔洞。表面未覆蓋保護層的絲織品受到了更為嚴重的侵蝕，老化3年的絲織品表面可以觀察到明顯的孔洞和裂痕，被破壞/侵蝕區域的面積占比為 76%±5% ，超過在海洋沉積物中埋藏7年的表面覆蓋有保護層的絲織品。隨著老化時間的延長，埋藏7年的未覆蓋保護層的絲綢表面的破壞程度更加嚴重，被破壞/侵蝕區域的面積占比高達 92%±7% 。推測是埋藏環境較為潮濕，海洋沉積物里含有大量的微生物，保護層的存在阻擋了微生物對絲織品的降解，因此表面未覆蓋保護層的絲織品表面破壞程度更為嚴重。

圖1馬斯特蘭德港埋藏絲綢樣品的數碼照片

Fig.1Digital photographic images of silk samplesburiedatMarstrand Harbor

圖2馬斯特蘭德港埋藏絲綢樣品的掃描電鏡照片Fig.2SEMimagesofsilksamplesburiedatMarstrandHarbor

表1老化絲綢樣品表面被破壞/侵蝕區域的面積占比

Tab.1Percentage of area of damaged/eroded areas on the surface of aged silk samples

2.2紅外光譜及二級結構分析

絲纖維的物理化學性質與絲素蛋白的二級結構有著緊密的聯系，傅里葉紅外光譜儀對蛋白質二級結構的變化十分靈敏，因此被廣泛地應用于絲素蛋白二級結構的研究中。酰胺I區 1623cm^-1 處的吸收峰和酰胺Ⅱ區 1514cm^-1 處的吸收峰屬于絲素蛋白 β -折疊構象的特征吸收峰，酰胺IⅢI區1230cm^-1 處的吸收峰也屬于絲素蛋白 β -折疊構象的特征吸收峰， 964cm^-1 處的吸收峰是柞蠶絲素蛋白的特征峰，是由C—N鍵伸縮振動產生的，同樣歸屬于柞蠶絲素蛋白 β -折疊構象的特征吸收峰，與柞蠶絲素蛋白序列中的“Ala-Ala”肽段緊密相關[22]。圖3為絲素蛋白埋藏處理前后的紅外光譜圖。由圖3可以看出，表面未覆蓋保護層的絲織品埋藏處理7年后，絲素蛋白的二級結構發生了明顯的變化， 964cm^-1 處的特征吸收峰已經消失不見， 1623cm^-1 和 1514cm^-1 處的特征吸收峰強度明顯降低，說明絲素蛋白的結晶區遭到了嚴重破壞；1 230cm^-1 處的特征吸收峰消失殆盡，說明絲素蛋白的 β 折疊構象也遭到了嚴重的破壞。其余老化時間較短及覆蓋了保護層的絲素蛋白并未發生特征峰的消失或吸收峰增多的現象，說明其二級結構的類型尚未發生明顯的改變。

圖3馬斯特蘭德港埋藏絲綢樣品的紅外光譜

Fig.3FTIRspectraofsilksamplesburiedatMarstrandHarbor

為了更準確地探究埋藏處理前后絲素蛋白二級結構相對含量的變化，本文對酰胺IⅢI區（ 1300～1180cm^-1 ）的紅外光譜進行分峰處理，得到了絲素蛋白二級結構的相對含量，如圖4所示。由圖4可見，未處理的絲素蛋白的 β -折疊分子構象的相對含量約為 36% ，隨著埋藏時間的延長，表面未覆蓋保護層的絲織品絲素蛋白 β -折疊分子構象的相對含量呈現上升趨勢；埋藏2年后， _?β_? -折疊分子構象相對含量已升至 43% ，在老化后期，絲素蛋白 β -折疊分子構象相對含量又呈現出了下降趨勢；埋藏3年和7年的絲素蛋白 β -折疊分子構象相對含量分別下降至約 21% 和 16% 。覆蓋了保護層的絲素蛋白的二級結構表現出了同樣的變化規律， β -折疊分子構象的相對含量也是先上升后下降，埋藏時間最久的絲素蛋白酰胺IⅢI區被徹底破壞，已無法進行分峰處理。根據相關研究顯示[23-24]，非結晶區域結構較為松散，推測在老化前期絲素蛋白的 α -螺旋分子構象和無規卷曲分子構象比 β -折疊分子構象更容易被破壞，導致在老化前期 β -折疊分子構象的相對含量呈上升趨勢；隨著老化時間的延長，排列緊密的結晶區域無法抵抗外界因素的影響，β-折疊分子構象被大量破壞，最終結晶區被徹底破壞，導致絲織品失去原有的物理化學性能。

圖4馬斯特蘭德港埋藏絲綢樣品的二級結構相對含量示意Fig.4Secondary structure contents of fibroin from silk samplesburiedatMarstrandHarbor

2.3 蛋白組學分析

選擇對照樣和老化最嚴重的7Uncover樣品進行蛋白組學分析，圖5（a）為蛋白組學分析得到的絲素蛋白和肽段數量。由圖5（a）可以看出，在對照樣中檢測到46種蛋白質，埋藏后蛋白質的種類下降為31，說明絲素蛋白受到了嚴重破壞，部分蛋白質已被完全降解。未處理的對照樣中共有74條肽段，而埋藏后的7Uncover樣品中僅剩下35條肽段，說明絲素蛋白在海洋沉積物中埋藏之后，一些肽段被完全降解。Fibroin和Actin是蛋白組學鑒定出的最為可信且豐度最靠前的蛋白，圖5（b）為來自Fibroin和Actin的肽段數量，可見歸屬于Fibroin和Actin的肽段數量大幅下降，說明絲蛋白受到了嚴重的破壞。

為了進一步探討肽段的變化，本文分析了肽段的長度分布，如圖6所示。由圖6可知，Control樣的肽段長度主要分布在5～30個氨基酸內，其中20個左右氨基酸長度的肽段最多，然而在7Uncover樣中20個左右氨基酸長度的肽段數量幾乎為零，說明此長度的肽段極易被降解。考慮到絲素蛋白發生的變化是由埋藏引起的，埋藏環境的pH值為 7.2～7.5^[25] ，呈中性，避免了光照及酸堿性的影響，故本文推測蛋白質發生了水解反應或受到了微生物的影響。

3結論

本文通過蛋白組學與結構分析相結合的方法，系統揭示了絲綢在海洋沉積環境中的自然老化機理。結果表明，絲綢老化呈現明顯的階段性特征，其微觀形貌、二級結構與分子組成均發生顯著變化，且保護層的存在顯著延緩了老化進程。展望未來，隨著分析技術的不斷發展，如超高分辨質譜、先進的成像技術和多維光譜分析，有望進一步提升對古代絲綢遺存的分子水平認知。主要結論如下：

1）老化過程中絲纖維表面出現微原纖維脫落、孔洞及裂痕（SEM顯示侵蝕面積最高達 92% ） δ_?β -折疊含量呈先升后降趨勢（FTIR分析表明從 36% 升至 43% 后降至 16% ），證實非晶區優先降解，后期結晶區瓦解導致力學性能喪失。

2）蛋白組學分析顯示老化后蛋白質種類減少 33% （ 46 31），來自構成絲素蛋白結晶區域的fibroin肽段數量大幅下降，表明微生物和水解作用導致絲素蛋白大分子鏈斷裂為小分子片段。

3）覆蓋保護層的樣品老化速率顯著降低（7年侵蝕面積：未覆蓋 92% →覆蓋保護層 65% ），為文物原位保護提供了直接依據；針對絲綢文物的保護與修復需求，可利用本文的降解機制研究成果，探索更精細的微環境調控手段，進一步優化保護策略。

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A study on the natural ageing mechanism of silk based on proteomics and structural analysis

KANGXiaojing1，DINGChuanmiao2，MALin2，WANGBing2 （1.XinjiangUygur Autonomous Region Instituteof Cultural Relicsand Archaeology，Urumqi 83oo11，China; 2.College of Materials Science amp;Engineering，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

Abstract：Ancient silkisan importantsymbol of Chineseculture，carryingrich historical valueandcultural significace.Itnotonlyrecordstheorigin，developmentandtechnologicalinnovationofChina’sancientsilkindustrybut alsodemonstrates theancient Chinesepeople’spursuitofbeautyandtheuniquestyleofChineseculturethrough its exquisite patternsandcolor motifs.However，duetotheinherentcharacteristicsofnaturalproteinfibers，silkartifactsarehighly susceptible todamagebyexogenous factors，suchasphysical，chemicalandbiological influences.Asthe primary componentofsilk，fibroinundergoesalterations initscomplex hierarchicalstructure during theagingprocess，consequently leadingtothedeteriorationofboth morphologyand structureinsilkartifacts.Inrecent years，with the progressof analysis anddetection technology，biological methodssuchasproteomicsand metabolomics havebeen introduced intothefieldof silkresearch，providinganewperspective forrevealing theaging mechanismofsilk．Theaplicationof theseadvanced technologies notonlydeepenstheunderstandingof theaging mechanismofsilk，butalsoprovidesascientificbasis forthe protectionandresearchof silkculturalrelics.Therefore，an in-depth studyof theaging processof silk fibersiscrucial for thedevelopmentof effctive strategies forheritageconservation.Curently，most studies havefocusedontheeffectsof singlefactorsonthedegradationof silkproteins，butstudiesonthecombinedeffectsofmultiplefactorsarestillinsuficient.

Toreveal the agingmechanism of silk fabrics under natural conditions，this paper buried silk in marine sediments to simulate thenaturalagingprocessofsilkartifacts inordertootainartficial simulatedsamplesofsilkartifacts，analyed the micro-morphologyofsilk fibersandthechangesof thesecondarystructureofthesilkpigment proteins byscanning electron microscopeandFourier infraredspectroscopy，and furtherused proteomicstechnologytostudythe naturalaging mechanism ofsilk fromthelevelof proteinmolecule.Inthispaper，thedegradationmechanismofsilkburiedinmarinesediments was evaluated from thesurface morphology，secondarystructureandproteinmolecularlevel，providingreferencefor understandingthenaturalagingprocessofancientsilkanditsinfluencingfactors.Theexperimentalresultsshowedthatthe surfacecolorofsilkchanged significantlyafteraging，andalarge numberof microprimaryfibers，fine fiberdetachmentand holesappearedonthesurfaceofsilkfibers；themolecularconformationofsilkproteinwasdamaged，andtherelative content of β -foldingshowedatendencytoincrease firstlyand decreaselater;inthepre-aging period，theamorphousregions of silk protein were more easily damaged;the tightly arranged crystaline regions were similarly damaged inthepost-aging period，and eventuallytransformed intoalooseamorphousstructure；some proteinsandpeptides disappearedafteraging， andthecontentof majorproteins decreased significantly，indicating thatpartof themacromolecular structure hasbeen degradedintosmallpeptides oraminoacids.This study isof great significanceforthe in-depth understandingof the aging mechanismofancient silk，whichcanprovideanimportantbasisforthedevelopmentoftargetedconservationand restoration strategies for silk cultural relics.

This work laysafoundationforunderstanding thenaturalaging process of ancient silkandits influencingfactors，and alsoprovidesatechnicalframeworkforsubsequentresearchonsilkartifacts.Meanwhile，fortheprotectionandrestoration nedsof silkculturalrelics，thedegradationmechanismresearchresultsofthisstudycan beused toexplorefiner microenvironmental regulation means and optimize the protection strategy.

Key words：silk fabric；natural aging；aging mechanism；proteomics；structural analysis；secondary structure