貝類精子及幼蟲冷凍保存研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S917 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-3188（2025）03-057-08

貝類精子及幼蟲超低溫保存技術(shù)是一項(xiàng)有價(jià)值的技術(shù)，通過超低溫冷凍保存這項(xiàng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定保存，在種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳改良領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)的核心在于建立標(biāo)準(zhǔn)化貝類種質(zhì)資源庫(kù)，顯著降低瀕危物種與受過度捕撈影響種群的遺傳多樣性衰減風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為遺傳育種工程提供可溯源的配子與胚胎生物樣本，顯著提升種質(zhì)資源利用效率和遺傳改良研究可行性。

1超低溫冷凍保存原理與損傷機(jī)制

低溫生物學(xué)是研究生物體系在低溫環(huán)境中生理響應(yīng)機(jī)制及其應(yīng)用技術(shù)的交叉學(xué)科，涵蓋從分子尺度到生態(tài)系統(tǒng)的多層次低溫適應(yīng)規(guī)律解析。低溫指 0^°C 至-80^°C 區(qū)間，而超低溫特指 ?-150^°C 的極端低溫環(huán)境（如液氮 -196^°C ）。該學(xué)科理論表明，生命中的一切生命過程都需要酶的參與，盡管每一種生命過程都是以各種方式進(jìn)行的，但它們的活力都是受溫度變化的，當(dāng)它們的溫度降到一定程度時(shí)，它們就會(huì)短暫地“失活”，進(jìn)入一種能量消耗最小的階段，這樣就可以將它們儲(chǔ)存起來(lái)，然后在解凍之后再被喚醒，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。1949年，英國(guó)生物學(xué)家Ploge和 Smith^[1] 在《自然》發(fā)表里程碑論文，首次證實(shí)甘油作為冷凍保護(hù)劑可使禽類精子在 -79^°C 長(zhǎng)期存活，此舉奠定現(xiàn)代生殖細(xì)胞低溫保存的理論基礎(chǔ)。

低溫常被應(yīng)用于細(xì)胞和組織的短時(shí)貯存，而超低溫常被應(yīng)用于長(zhǎng)時(shí)貯存。低溫生物學(xué)作為生物醫(yī)學(xué)工程的核心支撐學(xué)科，其技術(shù)外延涵蓋再生醫(yī)學(xué)（干細(xì)胞庫(kù)）、保護(hù)遺傳學(xué)（種質(zhì)資源庫(kù)）及航天生物學(xué)（地外生命保存）等前沿領(lǐng)域。例如：在醫(yī)療領(lǐng)域，超低溫冷凍可以保存血液、精子、皮膚等組織；應(yīng)用超低溫冷凍法進(jìn)行小白鼠的早期胚胎的長(zhǎng)期保存也在農(nóng)業(yè)方面被廣泛應(yīng)用[2-3]

雖然低溫保存技術(shù)可以延長(zhǎng)精子的壽命，但是如果操作不良（如應(yīng)用于組織樣本時(shí)），仍可能造成不可逆損傷。因此，在低溫保存過程中，需添加保護(hù)劑并控制適宜的冷卻速率，以最大限度減少損傷。研究發(fā)現(xiàn)，大部分凍結(jié)損傷發(fā)生于 0～-60^°C 的臨界溫度區(qū)間，其中冰晶損傷、滲透壓損傷、過冷休克、抗凍劑毒害等是凍結(jié)損傷的主要原因[2]。

（1）冰晶損傷

在超低溫冷凍生物樣本的過程中，冰晶損傷是最常見的損害因素之一。其根本原因在于快速冷卻：當(dāng)溫度低于零攝氏度時(shí)，細(xì)胞無(wú)法及時(shí)排出內(nèi)部水分，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶[4-5]，從而對(duì)細(xì)胞器和細(xì)胞膜造成機(jī)械性損傷。研究表明，鯉魚精子經(jīng)低溫保存復(fù)蘇后，電鏡掃描顯示其頭部和尾部細(xì)胞膜的破裂主要源于細(xì)胞內(nèi)冰晶[6]。此類損傷多發(fā)生于 -3～-60^°C 之間，在快速降溫實(shí)驗(yàn)中尤為顯著。當(dāng)溫度低于 -60^°C 時(shí)，游離水分完全凍結(jié)抑制了水分流動(dòng)，細(xì)胞損傷隨之減輕。添加抗凍保護(hù)劑可縮小冰晶危害的溫度范圍，顯著降低組織樣本損傷程度[7-12]

（2）滲透壓損傷

滲透壓損傷同樣源于冰晶形成。在超低溫冷凍生物樣本時(shí)，細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓差異會(huì)引發(fā)電解質(zhì)失衡：當(dāng)胞外溶液凍結(jié)導(dǎo)致溶質(zhì)濃度升高時(shí)，細(xì)胞通過水分外流試圖維持滲透平衡，這種劇烈的水分遷移會(huì)造成機(jī)械損傷[5.8-9，13]。具體而言，在低溫環(huán)境下，胞外溶液優(yōu)先凍結(jié)使得未凝固部分的電解質(zhì)濃度急劇上升，高滲環(huán)境不僅破壞細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，還會(huì)引發(fā)滲透性脫水一細(xì)胞內(nèi)水分通過滲透作用持續(xù)外流，脫水程度與細(xì)胞膜通透性及降溫速率呈正相關(guān)。研究表明，緩慢冷卻法會(huì)延長(zhǎng)溶質(zhì)濃縮過程，使?jié)B透壓損傷顯著加劇。

（3）過冷休克

在生物樣本的超低溫冷凍過程中，細(xì)胞與培養(yǎng)液均會(huì)發(fā)生凍結(jié)，且細(xì)胞的凍結(jié)程度通常較培養(yǎng)液更深。由于細(xì)胞膜對(duì)溫度變化高度敏感，當(dāng)環(huán)境溫度降至 0～-16^°C 時(shí)，其磷脂分子會(huì)發(fā)生相變并重排，形成剛性凝膠態(tài)結(jié)構(gòu)。這一過程導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性異常、胞內(nèi)物質(zhì)外滲及膜完整性喪失，最終引發(fā)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的不可逆損傷[3，5.8-9，14-15]。 。

（4）抗凍劑毒性

在超低溫冷凍生物樣本過程中，低溫保護(hù)劑（CPA）能有效減輕細(xì)胞損傷。其通過維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性并抑制冰晶生長(zhǎng)，顯著降低低溫對(duì)細(xì)胞的直接傷害。然而，部分保護(hù)劑如二甲基亞砜（DMSO）具有細(xì)胞毒性：高濃度下會(huì)破壞膜蛋白結(jié)構(gòu)，且滲透壓應(yīng)激可能引發(fā)線粒體功能異常。保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的損傷程度呈濃度依賴性，且受冷凍方式（快速凍結(jié)加劇滲透損傷，慢速凍結(jié)加重冰晶損傷）、保護(hù)劑濃度（濃度gt;10% 時(shí)化學(xué)毒性顯著升高）、平衡時(shí)間（短時(shí)暴露引發(fā)滲透休克，長(zhǎng)時(shí)暴露導(dǎo)致代謝抑制）這三類關(guān)鍵參數(shù)調(diào)控[5，8-9，14，16] 。

（5）pH損傷

在生物樣本的超低溫冷凍過程中，冷凍或復(fù)溫階段可能引發(fā)胞內(nèi)液體短暫?jiǎn)适Ь彌_性能，導(dǎo)致胞內(nèi)pH值失衡，進(jìn)而造成細(xì)胞代謝異常或不可逆的結(jié)構(gòu)損傷。研究表明，當(dāng)細(xì)胞懸浮液在 0～-55^°C 的共晶溫度范圍內(nèi)冷卻時(shí)，其組分凝固并形成致密晶體混合物。此類相變過程會(huì)破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物外泄，最終引發(fā)細(xì)胞功能障礙[3，5.8-9，12，14-15]。

（6）細(xì)胞容積效應(yīng)

超低溫冷凍過程中，細(xì)胞經(jīng)歷滲透性脫水導(dǎo)致體積收縮；復(fù)溫解凍時(shí)，水分快速內(nèi)流又引發(fā)細(xì)胞膨脹。這種雙向體積波動(dòng)是低溫保存的核心挑戰(zhàn)。當(dāng)體積變化幅度突破臨界閾值（通常為原生體積的 ± 25% ），細(xì)胞膜因張力超限發(fā)生不可逆破裂，最終導(dǎo)致程序性壞死。值得注意的是，在添加低溫保護(hù)劑的滲透平衡階段，細(xì)胞首先因胞外高滲溶液脫水收縮；隨著保護(hù)劑跨膜擴(kuò)散，胞內(nèi)滲透壓升高驅(qū)動(dòng)水分回流，此過程中反復(fù)的體積震蕩可造成亞致死性膜損傷[3，5，8-9，15] O

（7）重結(jié)晶損傷

生物樣本在冷凍保存期間會(huì)經(jīng)歷兩個(gè)階段的冰晶動(dòng)態(tài)演變：初始凍結(jié)階段中，當(dāng)溫度降至 -80^°C 以下時(shí)，小冰晶通過奧斯特瓦爾德熟化機(jī)制逐漸融合增大；復(fù)溫解凍階段中，在 -50^°C 至 0^°C 溫區(qū)內(nèi)，殘留的微冰晶會(huì)重新排列聚集形成更大晶體。這種冰晶重結(jié)晶現(xiàn)象通過雙重機(jī)制加劇細(xì)胞損傷一—增大的冰晶直接刺破細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜（機(jī)械損傷），同時(shí)因晶體生長(zhǎng)改變局部溶質(zhì)濃度梯度而引發(fā)二次滲透壓震蕩（滲透損傷）[17]。值得注意的是，此類損傷在以下場(chǎng)景中尤為顯著：慢速?gòu)?fù)溫（ gt;2%gt;2min ）導(dǎo)致樣本在 -30～-10^°C 危險(xiǎn)溫區(qū)滯留時(shí)間延長(zhǎng)；長(zhǎng)期儲(chǔ)存在玻璃化轉(zhuǎn)變溫度以上（如液氮?dú)庀鄥^(qū) -130^°C 環(huán)境），這為冰晶重組提供了持續(xù)的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力[5，8-9，12，14] O

2貝類精子超低溫冷凍保存的研究現(xiàn)狀

與哺乳類（1750年）和魚類（1953年）精子凍存相比，超低溫冷凍精子保存在貝類研究起步較晚，發(fā)展緩慢。從1970年代開始，由美國(guó)Hughes首次采用低溫冷凍的方法，在世界范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)長(zhǎng)牡蠣精子的冷凍保存[18]。自那以后，科研人員圍繞貝類精子冷凍保存技術(shù)開展系統(tǒng)研究，逐步優(yōu)化凍存方案，最終在實(shí)踐應(yīng)用中取得顯著進(jìn)展（表1）。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)貝類的低溫保存也有了一定的進(jìn)展，貝類精子的超低溫冷凍保存中最廣泛使用的抗凍劑為 10% ～20% （V/V）濃度的二甲基亞砜，最長(zhǎng)可以保存30d，精子的存活率最高可達(dá)67%[19]

3貝類幼蟲、胚胎超低溫冷凍保存的研究現(xiàn)狀

貝類精子低溫冷凍保存技術(shù)已成功應(yīng)用于種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)，但其卵子及胚胎的冷凍保存研究仍遠(yuǎn)滯后于精子。盡管卵子與胚胎的冷凍損傷機(jī)制與精子相似，但其體積龐大、卵黃物質(zhì)豐富且膜滲透性低，致使冰晶更易形成并造成不可逆損傷，技術(shù)難度顯著增加。因此，當(dāng)前研究聚焦于幼蟲階段的冷凍保存[31]

近年研究表明，貝類幼蟲冷凍保存取得了不小的進(jìn)展（表2），乙二醇與丙二醇因毒性較低成為優(yōu)選冷凍保護(hù)劑，而二甲基亞砜和甘油在高濃度時(shí)易引發(fā)膜系統(tǒng)損傷[32-34]。發(fā)育階段篩選顯示，D形幼蟲因具備完整幾丁質(zhì)外殼，可有效緩沖滲透壓變化，凍存存活率最高；擔(dān)輪幼蟲雖處于更早期發(fā)育階段且細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但因缺乏外殼保護(hù)及膜系統(tǒng)未成熟，對(duì)冷凍保護(hù)劑毒性極為敏感，即使縮短處理時(shí)間，存活率仍不足30%[32，35-37] 。

表1貝類精子超低溫冷凍保存研究方法

4.1稀釋液

4貝類超低溫保存影響因素與改進(jìn)

在生物樣本超低溫冷凍過程中，精子冷凍效果受多重參數(shù)調(diào)控：稀釋液類型、抗凍保護(hù)劑種類及濃度、凍存程序與解凍方法。其中，稀釋液體系與抗凍保護(hù)劑篩選是核心控制要素。

稀釋液配方具有顯著物種差異。針對(duì)貝類精子冷凍，研究多采用滅菌天然海水或改良D-Hank's液（細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)液[39]）作為基液[40]，其離子組成可模擬生殖腺內(nèi)環(huán)境。Kawamoto等[41]優(yōu)化珠母貝（Pinctadafucatamartensii）精子冷凍體系表明，含10% 甲醇的復(fù)合抗凍液（稀釋液組成為 80% 滅菌海水 +20% 胎牛血清）可使精子復(fù)蘇活力提升至（62.3±5.1）% [vs對(duì)照組（ 38.7±4.2）% ， Plt;0.01] 。楊培民等[42]系統(tǒng)評(píng)估蝦夷扇貝（Patinopectenyesoeni-si）精子凍存體系發(fā)現(xiàn)， 16% DMSO－海水抗凍液組精子復(fù)蘇活力達(dá)（ 47.0±4.4）% ，顯著高于甘油組[ （28.5±3.1）% 」和乙二醇組[（ 34.2±3.8）% 一（ Plt;0.05 ）。值得注意的是，貝類精子膜脂組成特殊（富含 ω_ω-3 多不飽和脂肪酸），這要求抗凍液需兼具膜穩(wěn)定與滲透壓緩沖功能。因此，血清蛋白的添加不僅能調(diào)節(jié)滲透壓梯度，其載脂蛋白組分還可通過結(jié)合膜磷脂防止低溫相變。

表2貝類胚胎及早期幼蟲超低溫冷凍保存研究方法

4.2抗凍保護(hù)劑

抗凍保護(hù)劑是一種能在極低溫下縮短高危溫區(qū)、減少低溫傷害、保護(hù)精子的物質(zhì)，但會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的傷害，抗凍劑對(duì)各個(gè)生物的效果各有不同，主要取決于抗凍保護(hù)劑的機(jī)理和表現(xiàn)在不同動(dòng)物有不同差異。按照抗凍保護(hù)劑的機(jī)制，將其劃分為滲透性和非滲透性兩種。

滲透性低溫保護(hù)劑可穿透至精子中，替代細(xì)胞內(nèi)水分，縮短危險(xiǎn)溫區(qū)，達(dá)到更低的凍結(jié)點(diǎn)，減少凍存時(shí)對(duì)細(xì)胞的傷害[43]。

目前應(yīng)用最多的是二甲基亞砜，哺乳類動(dòng)物中，馬麗等[44]用DMSO 和甘油作為滲透性冷凍保護(hù)劑，發(fā)現(xiàn) 6% DMSO比甘油更有利于豬精子的凍存；另外，在魚的精子凍存方面， 10% DMSO對(duì)黃顙魚（Pel-teobagrusfulvidraco）和大西洋大比目魚的精子進(jìn)行低溫保存效果均較好。然而，并不是所有動(dòng)物精子都由DMSO冷凍保存效果最好，例如Nahiduzzaman等[3]研究發(fā)現(xiàn)以 15% DMSO作為印度鯉魚精子中的抗凍劑，其效果不好；楊愛國(guó)等[45]對(duì)扇貝精子冷凍保存中發(fā)現(xiàn)濃度（V/V）為 8%～10% 的DMSO保存效果最好。

非滲透性冷凍保護(hù)劑主要是指大分子類，主要包括糖類、卵黃等一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)外非滲透性保護(hù)劑的研究多局限于哺乳類精子，還需進(jìn)一步研究大分子類的作用機(jī)理，非滲透性冷凍保護(hù)劑也被應(yīng)用于貝類精子凍存中，如韓龍江[25]將 0.45mol/L 的海藻糖加人到太平洋牡蠣精子保護(hù)劑中，能顯著提高其精子活力和受精率。

4.3降溫程序

當(dāng)前，根據(jù)其降溫方式，可分為兩種，一種是液氮蒸氣梯度法，通過調(diào)節(jié)樣本與液氮面的垂直距離（通常 5～20cm ），利用氣相區(qū)溫度梯度（-80～-196^°C ）控制冷卻速率，在目標(biāo)距離停留 2～5min 后浸入液氮儲(chǔ)存。該方法成本低廉、無(wú)需精密設(shè)備，適合養(yǎng)殖場(chǎng)等資源有限場(chǎng)景，但存在人工操作誤差大、樣本間降溫速率差異顯著等問題。第二種方法是程序控制降溫法，基于預(yù)設(shè)降溫曲線，通過液氮噴射系統(tǒng)和PID算法實(shí)現(xiàn) ±1^°C 精度控制，最終轉(zhuǎn)移至液氮存儲(chǔ)。相比前者，其降溫均勻性提升4倍，尤其適用于胚胎干細(xì)胞等敏感樣本，但設(shè)備購(gòu)置成本高，制約其在大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。

4.4復(fù)蘇方法

精子復(fù)蘇是超低溫冷凍保存技術(shù)中直接影響精子存活率的核心環(huán)節(jié)。目前主流的復(fù)蘇方法按溫度范圍分為三類：低溫冰水復(fù)蘇（ 0～5^°C ）、溫水復(fù)蘇（30～40^°C ）、高溫復(fù)蘇（ 50～80^°C ）。其具體選擇需根據(jù)物種特性、精液體積、解凍溫度以及精液與復(fù)溫液的比例進(jìn)行優(yōu)化[46]

關(guān)于復(fù)蘇方法多采用恒溫水浴對(duì)凍精解凍，吳麗云[47]曾對(duì)西施舌的精子進(jìn)行過低溫保存，并且解凍條件是在 35^°C 下進(jìn)行。太平洋牡蠣精子在 40^°C 的復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)中，其凍精活性明顯超過 30^°C 和 50^°C^[27] ，馬氏珠母貝精子在 20^°C 的水浴中進(jìn)行了15s的低溫復(fù)蘇[48]。Ding等[49]對(duì)大西洋大比目魚精子的復(fù)蘇條件進(jìn)行了研究，將其放置于 37^°C 的水中，使其輕微搖動(dòng) 3min ，然后在凍存管內(nèi)出現(xiàn)液體時(shí)，就把它從水浴鍋中移出來(lái)，在室溫下完全解凍。在太平洋牡蠣精子超低溫冷凍保存中，也有研究人員指出在 16^°C 流水解凍，效果最好，存活率可達(dá) 70% ，受精率與鮮精相比沒有明顯變化[50]

4.5抗氧化劑

在生物樣本低溫冷凍與解凍過程中，精子損傷機(jī)制呈現(xiàn)多因素耦合特征。氧化應(yīng)激雖非唯一損傷路徑，但其引發(fā)的膜脂過氧化（LPO）及DNA斷裂等不可逆損傷不容忽視?？寡趸瘎┩ㄟ^清除活性氧（ROS）或阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可有效維持精子膜流動(dòng)性及線粒體功能。然而，冷凍過程中精漿內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)（如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶）的防御能力顯著衰減，導(dǎo)致ROS濃度峰值可達(dá)基礎(chǔ)水平3～5倍。為此，研究者通過在抗凍液中添加外源抗氧化成分構(gòu)建二級(jí)防御體系，分為傳統(tǒng)抗氧化劑和納米抗氧化材料兩種。傳統(tǒng)抗氧化劑：維生素C（ S0～100μmol/L ）、 α- 生育酚 （0.5～2mmol/L [51]和SOD （50～200U/mL ）等通過電子轉(zhuǎn)移直接中和ROS；納米抗氧化材料：硒納米顆粒（ 10～50nm ）通過表面缺陷位點(diǎn)催化ROS分解，姜黃素納米載體（包封率gt;85%）實(shí)現(xiàn)靶向遞送[52]。

抗氧化物質(zhì)的量并非愈多愈好，相反，抗氧化物質(zhì)具有雙重性，過量則會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生不良作用。近期研究表明，抗氧化劑存在劑量-效應(yīng)拐點(diǎn)。近期研究顯示，當(dāng)維生素C濃度超過 200μmol/L 時(shí)，精子活力反而下降 23.7% （ Plt;0.05 ），這與其促氧化特性及膜滲透壓擾動(dòng)相關(guān)[53]。有研究人員發(fā)現(xiàn)，無(wú)冷凍保護(hù)劑的快速凍存方式（玻璃化凍存），因超快速降溫（ gt;1000^°C/min ）將ROS暴露時(shí)間縮短至毫秒級(jí)，DNA碎片指數(shù)（DFI）與新鮮樣本差異僅 1.8% ，其精子DNA損傷與人類新鮮精子樣本的DNA損傷最為相近[54]。傳統(tǒng)的慢速冷凍保存技術(shù)因相變期延長(zhǎng)（ 30～60min ）較之于玻璃化凍存氧化損傷更大，使線粒體ROS生成量增加2.3倍。所以說不同的降溫方式也影響精子的氧化物質(zhì)含量。因此，在低溫保存的同時(shí)，如何有效地抑制細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，提高細(xì)胞的抗氧化性能，是自前冷凍保存領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

4.6冷凍保護(hù)劑的輔助成分

在配置精子抗凍保護(hù)液的過程中，通常都會(huì)包含緩沖液、糖類，部分還會(huì)添加鹽類和抗生素。由于超低溫冷凍過程中胞內(nèi)液體緩沖能力短暫?jiǎn)适?，易引發(fā)pH 失衡，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂或不可逆損傷，因此需通過緩沖液維持胞內(nèi)外pH穩(wěn)態(tài)以保護(hù)精子[55]。冷凍保護(hù)劑中一般會(huì)添加糖類（如海藻糖）除為精子提供能量外，還可通過氫鍵結(jié)合替代胞內(nèi)自由水，抑制冰晶生長(zhǎng)并減少機(jī)械損傷。現(xiàn)階段，眾多研究為減少精子冷凍過程中的損傷，并提升復(fù)蘇后的生理特征，更集中于探索新的輔助成分。其中，含有多種氨基酸[56、環(huán)糊精－膽固醇復(fù)合物[57]、脂質(zhì)體、納米顆粒，以及熱應(yīng)激蛋白質(zhì)等。新添加的成分被用于提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)轉(zhuǎn)變凝膠化晶態(tài)的轉(zhuǎn)變程度，從而降低冷凍過程中可能發(fā)生的損傷，提高復(fù)蘇后的精子活力和功能。

近期，通過超聲波振動(dòng)和電磁場(chǎng)技術(shù)調(diào)控水分子行為，已經(jīng)成為一種創(chuàng)新的嘗試。電磁場(chǎng)可以破壞水分子間的有序排列，從而影響晶體的結(jié)晶形態(tài)及尺寸的變化[58]。此外，通過電磁場(chǎng)來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)線粒體的膜電位，可以有效降低活性氧產(chǎn)生，延長(zhǎng)凍存細(xì)胞代謝活性[59]。同時(shí)，利用超聲空化作用，當(dāng)超聲波震動(dòng)達(dá)到一定頻率時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的微氣泡瞬間破裂與潰滅，加速冰晶體的過早成核和降低過冷現(xiàn)象出現(xiàn)，進(jìn)而改善凍存后的復(fù)蘇效果[60]。上述物理場(chǎng)輔助技術(shù)為精子低溫保存研究提供了新思路，尤其在冰晶形態(tài)控制及氧化應(yīng)激緩解方面具有重要優(yōu)化潛力。

4.7精子冷凍保存技術(shù)的改進(jìn)

玻璃化冷凍保存技術(shù)是指將微量的精液（通常 lt; 0.5mL ）浸入在液氮中實(shí)現(xiàn)急速冷卻（降溫速率 gt; 1000°C/min ）[61]。該技術(shù)突破性地規(guī)避了傳統(tǒng)冷凍對(duì)滲透性保護(hù)劑（如甘油）的依賴，從根本上消除滲透性休克導(dǎo)致的膜破裂風(fēng)險(xiǎn)。玻璃化凍存技術(shù)根據(jù)相變控制策略可分為平衡冷凍法（慢速控冰）、冷干燥法（升華脫水）、高溫玻璃化法（零上溫度維持玻璃態(tài)）、高濃度CPA玻璃化法（滲透保護(hù)劑濃度 gt;6 mol/L）、無(wú)保護(hù)劑玻璃化法（超高速降溫實(shí)現(xiàn)非晶態(tài)固化）[62]。當(dāng)前精子玻璃化凍存一般采用后面高濃度CPA玻璃化法和無(wú)保護(hù)劑玻璃化法兩種方法。但需要注意的是，如乙二醇雖能抑制冰晶生長(zhǎng)，卻可能引發(fā)滲透壓震蕩損傷線粒體嵴結(jié)構(gòu)。提高凍結(jié)速度，降低滲透性保護(hù)劑的濃度，可能減輕此損害[63]。實(shí)際上，Schuster等[4將此凍存方法（含 12% 甘油）與傳統(tǒng)凍存方法比，發(fā)現(xiàn)在精子活性方面沒有明顯的差別。最近，Zhou等人[采用微劑量多階段玻璃化法（ 25μL 凍存管 +100mmol/L 甘氨酸）使人類精子復(fù)蘇存活率達(dá) 65.8% ，且DNA碎片指數(shù)降低至

14.2% （傳統(tǒng)法 21.5% ）。在保護(hù)劑替代研究領(lǐng)域，Nawroth等[6]開創(chuàng)性地使用非滲透性大分子（如卵黃蛋白）構(gòu)建物理屏障，其冷凍損傷機(jī)制與滲透保護(hù)劑存在本質(zhì)差異：前者通過氫鍵網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定膜磷脂，后者依賴滲透壓平衡。此外，Schulz等[]系統(tǒng)對(duì)比糖類保護(hù)劑效能，發(fā)現(xiàn)海藻糖組精子活力維持率（ 62.4% ）顯著高于蔗糖組（ 41.7% ）。

5展望

超低溫冷凍保存技術(shù)作為現(xiàn)代種質(zhì)資源保護(hù)的核心策略，在提升遺傳改良工程體系效能、促進(jìn)水產(chǎn)種業(yè)規(guī)?；a(chǎn)及瀕危物種遷地保護(hù)等方面展現(xiàn)出重要應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)基于生物代謝低溫抑制原理，通過程序化控溫實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與組織樣本的時(shí)序性保存。其中，超低溫冷凍保存通過將生物材料置于液氮相變溫度以下，使細(xì)胞進(jìn)入代謝靜止態(tài)，有效終止氧化應(yīng)激反應(yīng)和酶促降解過程，從而維持遺傳物質(zhì)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，現(xiàn)已被證實(shí)為保障生物樣本遺傳完整性的金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體系。

在保護(hù)生物學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)通過構(gòu)建瀕危物種種質(zhì)資源庫(kù)，實(shí)現(xiàn)遺傳多樣性的原位保全和離體再生，為種群復(fù)壯提供關(guān)鍵生物材料。盡管貝類配子冷凍保存研究相較于哺乳動(dòng)物及硬骨魚類存在明顯時(shí)序滯后性，但近年來(lái)針對(duì)長(zhǎng)牡蠣貽貝、扇貝、珍珠牡蠣、皺紋盤鮑等重要經(jīng)濟(jì)物種的精子冷凍保存研究已取得顯著進(jìn)展。研究表明，貝類精子質(zhì)量呈現(xiàn)多維動(dòng)態(tài)特征，其不僅受親本性腺發(fā)育階段、滲透壓適應(yīng)能力等內(nèi)源性生理參數(shù)調(diào)控，更與冷凍保護(hù)劑滲透壓梯度、降溫速率等外源性技術(shù)參數(shù)存在顯著交互作用。

現(xiàn)有文獻(xiàn)系統(tǒng)證實(shí)，二甲基亞礬因其跨膜滲透效率與冰晶抑制效應(yīng)的雙重優(yōu)勢(shì)，在多數(shù)貝類精子冷凍保存中表現(xiàn)出普適性保護(hù)效能。然而當(dāng)前研究多聚焦于冷凍程序參數(shù)優(yōu)化（如抗凍劑濃度篩選、平衡時(shí)間確定），對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)損傷機(jī)制、線粒體膜電位變化等分子層面的冷凍應(yīng)激響應(yīng)研究仍顯不足。值得注意的是，哺乳動(dòng)物模型已證實(shí)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可通過表觀遺傳修飾影響配子冷凍耐受性，這為貝類低溫生物學(xué)研究提供了重要范式參考。

超低溫冷凍保存技術(shù)作為生殖細(xì)胞低溫生物學(xué)研究的核心手段，通過程序化冷凍策略實(shí)現(xiàn)水生生物遺傳資源的長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。基于該技術(shù)構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化貝類種質(zhì)資源庫(kù)，可完整保存雙殼綱（牡蠣、扇貝、蛤仔）和腹足綱（鮑魚）等經(jīng)濟(jì)物種的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，有效規(guī)避因過度捕撈或環(huán)境脅迫導(dǎo)致的遺傳多樣性不可逆衰減。該技術(shù)體系在遺傳育種領(lǐng)域展現(xiàn)出多維應(yīng)用價(jià)值，其不僅為全基因組選擇育種提供可溯源的配子與幼蟲生物樣本，還可通過玻璃化冷凍技術(shù)建立瀕危物種的遺傳信息備份系統(tǒng)，旨在為水產(chǎn)種業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供理論支撐和技術(shù)解決方案。

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