植物乳桿菌ATCC14917聯(lián)合海藻糖對APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成的影響

摘要：

探究植物乳桿菌ATCC14917以及海藻糖聯(lián)合植物乳桿菌ATCC14917對載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠動脈粥樣硬化的影響，選取8周齡雄性C57BL/6J野生型小鼠及雄性APOE-/-小鼠，C57BL/6J小鼠為空白對照組（WT），APOE-/-小鼠隨機分為對照組（Control）、模型組（Vehicle）、植物乳桿菌干預(yù)組（Lp）、海藻糖干預(yù)組（Tre）和植物乳桿菌聯(lián)合海藻糖干預(yù)組（Lp＋Tre）。Tre組、Lp組及Lp＋Tre組小鼠分別灌胃海藻糖、植物乳桿菌ATCC14917及二者組合物，WT、Control及Vehicle組小鼠灌胃PBS。12周后，測定小鼠血清TC、TG、HDLC及LDLC；肝臟HE染色；大體油紅O染色測定小鼠主動脈粥樣硬化斑塊面積。結(jié)果表明，與Vehicle組小鼠相比，Lp＋Tre組小鼠體重降低，肝體比減小；血清TC、TG及LDLC明顯降低；Lp＋Tre組小鼠肝臟HE染色結(jié)果與Control組相近。海藻糖會促進植物乳桿菌ATCC14917的增殖，植物乳桿菌ATCC14917可減輕小鼠動脈粥樣硬化，二者組合物可能通過降低APOE-/-小鼠的膽固醇水平進而抑制動脈粥樣硬化病變進展。

關(guān)鍵詞：

植物乳桿菌ATCC14917；海藻糖；動脈粥樣硬化；APOE-/-小鼠

中圖分類號：R542.2

文獻標(biāo)志碼：A

心血管疾病是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和致死率極高的疾病之一[14]，動脈粥樣硬化是造成心血管疾病的主要原因，是一種與脂質(zhì)沉積相關(guān)的慢性炎癥性疾病[56]，導(dǎo)致血管狹窄、動脈管壁內(nèi)形成斑塊，甚至使動脈血管閉塞，危害患者的生命[7]，改變生活方式以及減少危險因素可預(yù)防動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。目前，已有藥物用于動脈粥樣硬化的預(yù)防和治療，例如他汀類藥物，但對人體帶來的副作用較大，因此臨床上需要研發(fā)更為安全的抗動脈粥樣硬化藥物[8]，改善動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，當(dāng)攝入足夠數(shù)量時，會對人體健康產(chǎn)生有益作用，因此，可以作為一種新的潛在“藥物”來預(yù)防和治療動脈粥樣硬化[7]。植物乳桿菌屬于乳桿菌屬，是一種具有多種功效和優(yōu)良特性的益生菌，能夠降低機體膽固醇水平、調(diào)節(jié)炎癥過程、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和維持腸道菌群平衡等[9]。植物乳桿菌具有較好的耐酸和耐膽鹽特性，并且能夠定殖于人體胃腸道，對腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用[1011]。海藻糖是一種天然存在于細菌、真菌、酵母、昆蟲、植物和無脊椎動物中的非還原性雙糖[12]，在高溫、高壓等應(yīng)激環(huán)境中能夠有效地保護生物分子結(jié)構(gòu)不被破壞，維持生命體的生命過程和生物特征[13]。海藻糖通過誘導(dǎo)巨噬細胞清除殘余脂質(zhì)滴、功能失調(diào)的蛋白質(zhì)等細胞垃圾，清理動脈粥樣硬化斑塊，對動脈粥樣硬化起到保護作用[14]。本文以載脂蛋白E基因敲除（APOE-/-）小鼠為研究對象，通過高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化模型，探討海藻糖和植物乳桿菌ATCC14917組合物對APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌ATCC14917購自廣東省微生物菌種保藏中心。選取15只體重20～24 g的8周齡雄性C57BL/6J小鼠及75只雄性APOE-/-小鼠（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2021—0006），適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進行實驗。飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制為22～25 ℃，濕度為40%～60%，并進行晝夜各12 h的交替照明；小鼠自由進食，飲用水、鼠籠及墊料均高壓滅菌，每周更換墊料及水2次；使用的高脂飼料由基礎(chǔ)飼料添加15%脂肪和15%膽固醇制成。

1.2 主要試劑

培養(yǎng)基：自行配制無碳源、含有20%葡萄糖以及10%、20%、30%、50%海藻糖的6種MRS培養(yǎng)基；總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）測定試劑盒、油紅O染液和HE染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與菌懸液的制備 將凍干保存的植物乳桿菌ATCC14917接種在MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，按培養(yǎng)液1%的接種量進行接種，對L.plantarum活化傳代3次，將得到的菌液以4 000 r/min離心10 min，用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，離心結(jié)束棄掉上清，得到菌體沉淀物，向沉淀中加入等體積無菌PBS溶成菌懸液，調(diào)整菌液濃度為25×109 CFU/mL。

1.3.2 菌株鑒定 由華大基因工程有限公司對植物乳桿菌ATCC14917進行16SrRNA測序，并將測序結(jié)果與GenBank中的菌株序列進行同源性比對。

1.3.3 動物分組與模型建立 將APOE-/-小鼠隨機分成5組，每組15只，分別是造模對照組（Control）、高脂模型組（Vehicle）、植物乳桿菌干預(yù)組（Lp）、海藻糖干預(yù)組（Tre）以及植物乳桿菌聯(lián)合海藻糖干預(yù)組（Lp＋Tre），C57BL/6J雄性小鼠為空白對照組（WT）。WT組和Control組飼喂普通飼料并灌胃無菌PBS，Vehicle組飼喂高脂飼料并灌胃無菌PBS，Lp組飼喂高脂飼料并灌胃植物乳桿菌菌懸液（5×108 CFU/mL），Tre組飼喂高脂飼料并灌胃2%海藻糖；Lp＋Tre組飼喂高脂飼料并灌胃2%海藻糖＋植物乳桿菌菌懸液（5×108 CFU/mL）。每只小鼠每次灌胃200 μL，每天上午固定時間灌胃，持續(xù)12周，每兩周稱重一次。

1.3.4 動物取材 小鼠灌胃12周后，禁食12 h，眼球取血處死，將血液裝于EP管中靜置2 h，以3 000 r/min離心20 min，分離得到血清，置于無菌EP管中并保存于-80 ℃冰箱備用。用生理鹽水從心尖灌注小鼠心臟，沖洗主動脈中殘留血液，并分離主動脈，剝離主動脈周圍脂肪，浸泡于4%多聚甲醛溶液中。將其他組織（心、肝、脾、腎、腸）取材后用PBS清洗，部分浸泡在4%多聚甲醛溶液中，其余部分裝入EP管凍存于-80℃冰箱備用。

1.3.5 主動脈大體油紅O染色 將主動脈從4%多聚甲醛溶液中取出，置于玻璃皿內(nèi)，縱向切割主動脈，使用60%異丙醇進行脫色，然后用油紅O染液浸泡10 min，再用60%異丙醇分化，最后用蒸餾水清洗。用顯微鏡觀察并拍照，采用Image J軟件定量分析主動脈粥樣硬化病變面積，并使用GraphPad Prism 10對主動脈斑塊病變面積進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.6 血清血脂測定 將-80 ℃冰箱中保存的小鼠血清取出，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒測定血清中TC、TG、HDLC、LDLC的水平。

1.3.7 肝臟HE染色 將肝臟從4%多聚甲醛溶液中取出后包埋，冷卻后切成厚5 μm的切片。按照HE染色方法，先將切片在蘇木素染液中浸泡5 min，然后伊紅染色2 min，再經(jīng)過脫水、透明、封片，最后在顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

為保證菌株的種屬準(zhǔn)確性，對植物乳桿菌菌株進行鑒定。如圖1所示，革蘭氏染色后，實驗菌株在顯微鏡下呈現(xiàn)紫色，單個、成對或短鏈狀排列，為革蘭氏陽性菌。由表1可知，該菌株的16SrRNA測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫的序列具有同源性，是植物乳桿菌屬并且符合植物乳桿菌菌株特性。

2.2 海藻糖對植物乳桿菌ATCC14917增殖的影響

研究顯示，20%的海藻糖能夠提高植物乳桿菌的存活率并增強菌體的耐酸性[15]。探討海藻糖是否對植物乳桿菌ATCC14917的增殖有影響時，以2%葡萄糖作為對照組，1%、2%、3%、5%的海藻糖為實驗組，測定菌株生長曲線。如圖2所示，實驗組菌株增殖速度均高于對照組，當(dāng)菌株生長達到穩(wěn)定期時，以2%海藻糖為碳源的實驗組增殖高于其他實驗組，因此選取2%濃度的海藻糖用作后續(xù)實驗。

2.3 組合物對APOE-/-小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

如圖3和表2所示，相對于Control組，Vehicle組小鼠體重顯著升高（plt;005），說明高脂飲食會加速小鼠肥胖的形成，初步認為此高脂模型造模成功。Lp組和Lp＋Tre組小鼠的體重均顯著低于Vehicle組小鼠（plt;005），Lp＋Tre組的體重最低（plt;005），結(jié)果表明海藻糖和植物乳桿菌ATCC14917的組合物可以顯著降低小鼠體重。

分析表2，各組小鼠心臟指數(shù)差異不顯著，說明聯(lián)合干預(yù)對小鼠心臟無影響。Vehicle組、Tre組、Lp組和Lp＋Tre組的肝臟指數(shù)均高于WT組和Control組，其中，Vehicle組最高，說明高脂飲食會促進小鼠肝臟脂肪的堆積。與Vehicle組相比，Lp組和Lp＋Tre組的肝臟指數(shù)均降低（plt;005），其中，Lp＋Tre組降低最顯著（plt;005），說明Lp＋Tre的聯(lián)合使用對小鼠肝臟脂肪堆積的改善效果最佳。

2.4 組合物對APOE-/-小鼠主動脈粥樣硬化形成的影響

2.4.1 主動脈內(nèi)膜面油紅O染色檢測粥樣硬化斑塊情況 如圖4所示，WT和Control組小鼠主動脈弓段和內(nèi)膜面均沒有斑塊形成，而Vehicle和Tre組弓段和內(nèi)膜面均有較多斑塊形成；Lp組斑塊明顯減少，主要集中在弓段（plt;0001）；Lp＋Tre組整體斑塊顯著減少（plt;0001）。結(jié)果顯示，海藻糖單獨使用并不能抑制主動脈粥樣硬化病變，但其與植物乳桿菌ATCC14917的組合物能夠顯著減緩粥樣硬化病變。

2.4.2 主動脈根部油紅O染色分析粥樣硬化病變情況 通過油紅O染色小鼠主動脈根部橫截面，觀察其斑塊形成情況（圖5）。WT組小鼠主動脈腔壁光滑，且沒有斑塊形成；而APOE-/-小鼠在高脂飼料的喂養(yǎng)下，均形成不同程度的粥樣硬化斑塊。Lp＋Tre組斑塊明顯減少（plt;0001），與主動脈內(nèi)膜面大體油紅O染色結(jié)果相一致，說明海藻糖聯(lián)合植物乳桿菌ATCC14917能夠抑制動脈粥樣硬化。

2.4.3 組合物對APOE-/-小鼠血脂的影響 高膽固醇血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要危險因素，降低膽固醇成為預(yù)防心血管疾病的關(guān)鍵[16]。通過試劑盒檢測各組小鼠血清膽固醇水平，結(jié)果如圖6所示，與Control組相比，Vehicle組小鼠的TC、TG和LDLC水平顯著升高（plt;0001），而Lp和Lp＋Tre組的TC、TG和LDLC水平均低于Vehicle組（plt;0001）；與Vehicle組相比，Lp＋Tre組的HDLC水平顯著升高（plt;0001）。結(jié)果表明，海藻糖和植物乳桿菌ATCC14917的組合物能降低小鼠血清膽固醇水平，進而降低患動脈粥樣硬化的風(fēng)險。

2.4.4 組合物對APOE-/-小鼠肝臟病理學(xué)形態(tài)影響 通過HE染色觀察植物乳桿菌ATCC14917及海藻糖是否對小鼠的肝臟形態(tài)有影響。如圖7所示，Control組肝細胞形態(tài)正常，排列呈索狀，細胞核處于細胞中央；與Control組比較，Vehicle組肝細胞有較多脂滴空泡，細胞形態(tài)及排列異常，細胞核呈邊緣化；與Vehicle組比較，Lp組和Lp＋Tre組肝細胞脂滴空泡有所減少，細胞病理改變較輕。其中，Lp＋Tre組病理改變最輕，細胞形態(tài)及排列接近Control組。說明海藻糖和植物乳桿菌ATCC14917的組合物能夠減少高脂飲食造成的肝臟內(nèi)脂肪堆積，進而減輕對肝臟的損傷。

3 討論

植物乳桿菌對于低pH以及高膽鹽濃度環(huán)境具有很好的耐受性，具有的膽鹽水解酶可以解偶聯(lián)膽鹽成為游離膽鹽，游離膽鹽能夠與膽固醇結(jié)合并形成沉淀[17]。海藻糖是一種天然的非還原性二糖，被稱為“生命之糖”，對植物乳桿菌有保護作用，能夠增強菌體的活力并提高菌體的抗逆性。本研究選取APOE-/-小鼠進行高脂誘導(dǎo)以構(gòu)建高脂模型，Vehicle組小鼠體重顯著高于Lp＋Tre組，Vehicle組肝臟指數(shù)也顯著高于Lp＋Tre組，說明海藻糖和植物乳桿菌ATCC14917聯(lián)合使用可以通過減少小鼠肝臟脂肪量來降低小鼠體重。探討海藻糖與植物乳桿菌ATCC14917組合物干預(yù)對APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化的影響時發(fā)現(xiàn)，Vehicle組動脈粥樣硬化斑塊形成較多，而Lp＋Tre組的粥樣硬化斑塊顯著少于Vehicle組，證明組合物能夠抑制小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的形成，進而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。

高膽固醇血癥是造成動脈粥樣硬化以及其他心血管疾病的重要因素，研究表明，乳酸桿菌菌株具有降低血清膽固醇的作用[18]，例如植物乳桿菌ATCC14917[19]。高脂飲食會增加血液中TC、TG以及LDLC的水平，進而增加患動脈粥樣硬化的風(fēng)險。LDLC被認為是動脈粥樣硬化的最危險因子[20]，高脂飲食結(jié)束時，APOE-/-小鼠血清TC、TG和LDLC水平顯著升高（plt;0001），HDLC水平顯著降低（plt;0001），而Lp＋Tre組小鼠血清TC、TG和LDLC水平顯著降低，HDLC水平升高。表明海藻糖與植物乳桿菌ATCC14917組合物能降低小鼠血清中膽固醇的含量，從而減少動脈粥樣硬化的發(fā)生。高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠在灌胃L.plantarum KY1032和L.curvatus HY7601菌株3周后，血清中的TC、TG和LDLC水平均顯著降低[21]；高脂小鼠在灌胃L.plantarum KCTC3928菌株4周后，與高脂模型組相比，血清中的LDLC和TG水平分別降低了42%和32%[22]；使用L.plantarum CUL66菌株灌胃小鼠12周后，TC和LDLC水平降低，但是TG水平卻有所升高[23]；植物乳桿菌不僅可以降低小鼠的血清膽固醇水平，還可以降低人體內(nèi)膽固醇水平，并且在膽固醇水平較高的患者中表現(xiàn)出較好的治療效果[24]。本研究結(jié)果與已有研究結(jié)果基本類似但略有差別，可能與菌株種類、實驗動物、灌胃周期等因素有關(guān)。

炎癥反應(yīng)、血脂升高和肝臟脂肪的堆積都可能導(dǎo)致動脈粥樣硬化及其他心血管疾病的發(fā)生，肝臟中脂肪沉積過多會導(dǎo)致其發(fā)生慢性炎癥或者出現(xiàn)肝損傷[25]。本研究結(jié)果顯示，Vehicle組的肝臟指數(shù)顯著高于Lp＋Tre組，肝臟病理學(xué)分析顯示，Lp＋Tre組肝臟脂質(zhì)沉積減少，空泡化程度減小。因此，海藻糖與植物乳桿菌ATCC14917的組合物可減少肝臟內(nèi)由于高脂飲食導(dǎo)致的脂肪累積，從而起到保護肝臟的作用。

4 結(jié)論

本文通過體內(nèi)外實驗證實2%的海藻糖可以促進植物乳桿菌ATCC14917的增殖，高脂飲食加速了APOE-/-小鼠動脈粥樣硬化形成，導(dǎo)致肝臟脂肪沉積，對肝臟造成損傷。植物乳桿菌ATCC14917具有顯著降低膽固醇的作用，并且減少了血清中TC、TG及LDLC的水平，但降膽固醇的具體機制和相關(guān)信號通路還需進一步探究。

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