虎杖苷對擴張型心肌病大鼠心肌損傷的影響

[摘要] 目的 基于音猬因子（sonic hedgehog，Shh）/神經膠質瘤相關致癌基因同系物1（glioma-associated oncogene 1，Gli1）信號通路探討虎杖苷（polydatin，PD）對阿霉素誘導擴張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）大鼠心肌損傷的影響。方法 60只SD大鼠采用隨機數字表法分為Con組、DCM組、PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組、Cyclopamine組，每組10只。除Con組外，其余組均通過阿霉素誘導構建DCM大鼠模型。檢測各組大鼠心功能指標，觀察大鼠心肌組織病理、纖維化改變及心肌細胞凋亡。檢測大鼠血清炎性相關因子水平與心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達，檢測各組大鼠心肌組織Shh/Gli1信號通路蛋白表達。結果 與Con組比較，DCM組大鼠心肌組織病理損傷和纖維化嚴重，心臟左室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、心肌細胞凋亡率、白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度值增加（Plt;0.05）。左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，FS）、Shh、Gli1表達降低（Plt;0.05）。與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠的心肌組織病理損傷和纖維化減輕，LVESD、LVEDD、心肌細胞凋亡率、IL-1β、IL-18、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度減少，LVEF、FS、Shh、Gli1表達增加（Plt;0.05）。與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠的心肌組織病理損傷和纖維化加重，LVESD、LVEDD、心肌細胞凋亡率、IL-1β、IL-18、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度顯著增加，LVEF、FS、Shh、Gli1表達顯著減少（Plt;0.05）。結論 PD通過激活Shh/Gli1信號通路能夠改善DCM大鼠心肌損傷。

[關鍵詞] 虎杖苷；音猬因子/神經膠質瘤相關致癌基因同系物1；擴張型心肌病；心肌損傷

[中圖分類號] R542.2" """"[文獻標識碼] A """""[DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2025.23.005

Effect of polydatin on myocardial injury in dilated cardiomyopathy rats

CHEN Xubo， YAO Qian

Department of Cardiovascular Medicine， Jinhua Central Hospital， Jinhua 321000， Zhejiang， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of polydatin （PD） on myocardial injury in rats with doxorubicin-induced dilated cardiomyopathy （DCM） based on the sonic hedgehog （Shh）/glioma-associated oncogene 1 （Gli1） signaling pathway. Methods A total of 60 SD rats were divided into six groups using a randomization method： Con group， DCM group， PD low-dose group， PD medium-dose group， PD high-dose group， and Cyclopamine group， each group contained 10 rats. Except for the Con group， all other groups were induced with doxorubicin to establish DCM rat models. The cardiac function parameters of each group were measured， and pathological changes including myocardial tissue fibrosis and cardiomyocyte apoptosis were observed. Serum inflammatory factors， type Ⅰ and type Ⅲ collagen expression in myocardial tissues， as well as Shh/Gli1 signaling pathway protein expression in myocardial tissues of all groups were analyzed. Results Compared with Con group， rats in DCM group exhibited more severe histopathological damage and fibrosis in myocardial tissues. Significant increases were observed in left ventricular end-systolic diameter （LVESD）， left ventricular end-diastolic diameter （LVEDD）， myocardial cell apoptosis rate， as well as the average absorbance values of interleukin （IL）-1β， IL-18， type Ⅰ collagen， and type Ⅲ collagen （Plt;0.05）. Left ventricular ejection fraction （LVEF）， left ventricular fractional shortening （FS）， Shh， and Gli1 expression levels decreased significantly （Plt;0.05）. Compared with the DCM group， histopathological damage and fibrosis reduced in the PD low-dose， medium-dose， and high-dose groups. LVESD， LVEDD， myocardial cell apoptosis rate decreased，and average absorbance values of IL-1β， IL-18， type Ⅰ collagen， and type Ⅲ collagen reduced. LVEF， FS， Shh， and Gli1 expression levels increased significantly （Plt;0.05）. Compared with PD high-dose group， pathological damage and fibrosis of myocardial tissue increased， while LVESD， LVEDD， cardiomyocyte apoptosis rate， IL-1β， IL-18，average absorbance of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen increased， and expression of LVEF， FS， Shh and Gli1 Decreased in cyclopamine group （Plt;0.05）. Conclusion PD may improve cardiomyopathy in DCM rats by activating Shh/Gli1 signaling pathway.

[Key words] Polydatin; Sonic hedgehog/glioma-associated oncogene homolog 1; Dilated cardiomyopathy; Myocardial injury

擴張型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是以心室擴張和心肌收縮功能障礙為主要特征的器質性心臟病，其核心病理改變表現為左心室進行性擴張，伴隨心肌收縮力持續下降^[1]。在心臟重構過程中，心肌細胞發生代償性肥大，間質纖維組織增生，最終導致心力衰竭^[2]。盡管當前DCM治療取得顯著進展，但長期預后生存率較低^[3]。為改變DCM生存率低與不良預后現狀，亟需深入探討DCM分子病理機制并研發新型藥物。虎杖苷（polydatin，PD）是一種天然二苯乙烯多酚類化合物，主要存在于虎杖根部、葡萄和花生中^[4-5]。PD表現出多種藥理學活性，如心血管保護、抗炎、抗凋亡、抗氧化等。研究表明PD可通過激活核因子E2相關因子/血紅蛋白加氧酶1信號通路，抑制氧化應激反應誘導的心肌細胞損傷^[6]。音猬因子（sonic hedgehog，Shh）是Hedgehog信號通路的核心配體，在調控胚胎發育、心臟發育及組織穩態方面發揮作用^[7-8]。神經膠質瘤相關致癌基因同系物1（glioma-associated oncogene 1，Gli1）作為編碼Hedgehog信號通路關鍵調控因子在細胞分化、組織發育等過程中扮演重要角色^[9-10]。研究發現激活Shh/Gli1信號通路可減輕缺氧/再氧合誘導的心肌細胞凋亡^[11]；但PD能否通過Shh/Gli1信號通路影響阿霉素誘導DCM大鼠心肌損傷尚未明確。本研究探討PD調控Shh/Gli1信號通路，揭示其對阿霉素誘導DCM大鼠心肌損傷的影響。

1 "材料與方法

1.1 "實驗動物

健康SD雄性大鼠，體質量180～200g，購自常州卡文斯實驗動物公司，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2022-0003。所有大鼠均飼養于恒溫恒濕，光照周期12h明暗交替的屏障環境，提供滅菌標準飼料和純凈水。本研究經金華市中心醫院醫學倫理委員會批準（倫理審批號：AL-JHYY202535）。

1.2 "試劑與儀器

PD（98%，HPLC）（碧云天生物技術公司）；阿霉素（美國AMCE公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin- eosin staining，HE）、Masson、終端原位末端轉移酶標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）染色試劑盒（美國Biosharp公司）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術公司）；大鼠白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18、酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國Sangon Biotech公司）；兔源一抗Ⅰ型膠原、Shh、Gli1、β-actin、山羊抗兔二抗（愛博抗公司）；二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒、Ⅲ型膠原抗體（美國Sigmaaldrich公司）；小動物無創超聲血流系統（塔正科技公司）；倒置熒光顯微鏡（明美光電技術公司）；多功能酶標儀（閃譜生物科技）。

1.3 "方法

1.3.1 "DCM大鼠模型構建及分組 "參照文獻[12]的方法構建DCM大鼠模型。采用阿霉素作為誘導劑，將其溶解于0.9%生理鹽水中，配制成1mg/ml標準溶液。大鼠每周接受腹腔注射阿霉素溶液，劑量為2.5mg/kg，持續6周，累計給藥劑量達15mg/kg。Con組大鼠給予相同劑量0.9%生理鹽水。最后一次給藥結束后，使用小動物無創超聲血流系統對Con組大鼠和DCM模型大鼠左室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）進行檢測，若LVEFlt;30%，提示DCM大鼠模型成功構建^[13]。建模成功的大鼠采用隨機數字表法分為DCM組、PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組、Cyclopamine組，每組10只。PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠均采取灌胃分別給予10、20、40mg/kg PD，Cyclopamine組大鼠在灌胃給予40 mg/kg PD基礎上，腹腔注射給予10mg/kg Shh/Gli1信號通路抑制劑Cyclopamine。Con組和DCM組給予等劑量生理鹽水，每天1次，持續7周。

1.3.2 "大鼠心功能指標檢測 "最后一次藥物干預后，通過乙醚誘導大鼠麻醉并置于手術臺，保持仰臥位固定四肢，采用小動物無創超聲血流系統進行心功能檢測，觀察各組大鼠心臟左室收縮末期內徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic dimension，LVEDD）、LVEF、左室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）的變化。

1.3.3 "大鼠血清IL-1β和IL-18水平檢測 "超聲檢測結束，采用脫頸法處死，收集心臟血液，置于4℃離心機分離血清，酶標儀進行測定。通過數據獲得標準曲線，最終計算得出各組大鼠血清IL-1β和IL-18水平。剩余血清置于-80℃低溫保存。

1.3.4 "大鼠心肌組織病理、纖維變化 "取部分心肌組織進行4%多聚甲醛固定24h并常規脫水、透明、浸蠟處理。使用組織包埋機完成包埋。將包埋組織通過切片機制備成4 μm切片，烘干備用。使用HE、Masson處理組織切片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織病理、纖維變化。

1.3.5 "大鼠心肌細胞凋亡變化 "通過TUNEL染色試劑盒處理切片，于顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞變化，計算各組大鼠心肌細胞凋亡率，即凋亡細胞數（綠色）/總細胞數×100%。

1.3.6 "大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達檢測 "取切片進行脫蠟、水化、抗原修復、H₂O₂封閉，滴加山羊血清，然后滴加一抗Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原（1：100）過夜處理。隨后，滴加二抗，室溫孵育1h，蘇木精復染，脫水、透明，中性樹膠封片，隨機選取5個視野顯微鏡下觀察，根據區域熒光強度總和/區域面積計算平均吸光度。

1.3.7 "各組大鼠心肌組織Shh/Gli1信號通路及凋亡相關蛋白表達 "將剩余心肌組織置于預冷DNA蛋白裂解液（含1%蛋白酶抑制劑）。使用勻漿機進行勻漿，離心收集上清液。采用試劑盒檢測蛋白濃度。每組取30 μg總蛋白，恒壓下進行電泳分離，濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，使用5%牛血清白蛋白封閉。4℃過夜孵育一抗Shh、Gli1、β-actin（均為1：2000）。然后，孵育相應二抗（1：3000）。滴加化學發光液孵育條帶、顯影。使用Image J軟件檢測灰度值，計算目的蛋白表達量即目的蛋白/β-actin灰度值比值。

1.4 "統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件對數據進行處理分析，計量資料以均數±標準差（"）表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步采用SNK-q檢驗進行兩組間比較。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1 "各組大鼠的心功能指標變化

與Con組比較，DCM組大鼠LVESD、LVEDD增加，LVEF、FS減少（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠LVESD、LVEDD減少，LVEF、FS增加（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠LVESD、LVEDD增加，LVEF、FS減少（Plt;0.05）。見表1。

2.2 "各組大鼠的血清IL-1β、IL-18表達水平變化

與Con組比較，DCM組大鼠血清IL-1β、IL-18水平增加（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-18水平減少（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠血清IL-1β、IL-18水平增加（Plt;0.05）。見表2。

2.3 "各組大鼠的心肌組織病理、纖維化改變

與Con組比較，DCM組大鼠的心肌組織損傷和纖維化嚴重，心肌細胞排列紊亂；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠的心肌組織損傷和纖維化減輕，心肌細胞排列趨于整齊；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠的心肌組織損傷和纖維化顯著加重，心肌細胞排列較紊亂。見圖1、圖2。

2.4 "各組大鼠的心肌細胞凋亡變化

與Con組比較，DCM組大鼠心肌細胞凋亡率增加（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠心肌細胞凋亡率減少（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠心肌細胞凋亡率增加（Plt;0.05）。見圖3。

2.5 "各組大鼠心肌組織膠原表達變化

與Con組比較，DCM組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度增加（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度減少（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原平均吸光度增加（Plt;0.05）。見圖4、圖5、表3。

2.6" 各組大鼠的心肌組織Shh/Gli1信號通路相關蛋白表達變化

與Con組比較，DCM組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達水平減少（Plt;0.05）；與DCM組比較，PD低劑量組、PD中劑量組、PD高劑量組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達水平增加（Plt;0.05）；與PD高劑量組比較，Cyclopamine組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達水平減少（Plt;0.05）。見圖6、表4。

3 "討論

DCM是以心室腔異常擴張和心肌纖維化為主要特征的原發性心肌病變，可導致進行性心力衰竭、心律失常及猝死風險顯著增加^[14-15]。目前DCM的治療方法主要是調控血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑及血管緊張素受體–腦啡肽酶抑制劑機制，改善心臟重塑和功能，同時應用β–受體阻滯劑對減輕心臟負荷具有重要意義，但仍面臨嚴峻的挑戰，缺乏針對DCM病理機制的特異性藥物，患者呈現進行性心功能惡化，5年生存率較低，且晚期患者預后較差^[16]。因此必須加快新型治療方案的研發進程。本研究采用阿霉素誘導DCM大鼠模型發現與Con組大鼠比較，LVESD、LVEDD顯著增加，LVEF、FS顯著減少，證明DCM大鼠造模成功。

在DCM發病過程中，免疫系統失調導致心肌組織處于炎癥狀態，進而引發心肌細胞損傷和凋亡。持續炎癥微環境不僅損害心肌細胞，甚至可導致心肌纖維化和心臟重塑^[17]。李偉等^[14]研究表明PD抑制Hippo/Yes相關蛋白通路，減少心肌組織炎性細胞浸潤和膠原纖維沉積，改善冠心病大鼠心肌損傷。王天光等^[18]研究顯示PD抑制轉化生長因子-β/Smad/細胞外信號調節激酶通路，減少促炎細胞因子IL-6、TNF-α表達水平，改善急性心肌梗死心肌纖維化程度，促進心肌損傷修復。以上研究結果表明PD具有改善心肌組織炎癥和纖維化療效。本研究DCM組大鼠心肌組織病理損傷和纖維化嚴重，心肌細胞凋亡率、促炎因子、心肌纖維化標志物平均吸光度增加。然而，DCM大鼠經不同劑量PD處理后，心功能指標LVESD、LVEDD降低，LVEF、FS升高，改善心功能，與王天光等^[18]研究結果一致。大鼠心肌組織促炎因子和心肌纖維化標志物表達降低，心肌細胞凋亡減少，提示PD可改善DCM大鼠炎癥反應和心肌組織纖維化。

Shh為分泌型信號分子，可與跨膜受體Patched特異性結合，激活下游因子Gli1，參與調節細胞增殖、分化、治療抵抗性及血管生成^[19]。最新研究發現Shh/Gli1信號通路在心肌損傷病理機制中具有關鍵調控作用。王琮翰等^[20]研究顯示激活Shh/Gli1信號通路，改善心功能指標、心肌梗死面積，進而減輕急性心肌梗死大鼠心肌損傷。上述研究結果證明Shh/Gli1信號通路激活對心肌細胞損傷具有顯著改善作用。本研究DCM大鼠心肌組織中Shh、Gli1表達降低；不同劑量PD處理DCM大鼠，Shh、Gli1表達增加。但使用Shh/Gli1信號通路抑制劑Cyclopamine可削弱PD對阿霉素誘導大鼠心肌保護作用，提示PD可能通過激活Shh/Gli1信號通路，在DCM病理進程中發揮心臟保護功能。

綜上，PD對DCM大鼠心功能、心肌損傷及纖維化表現出顯著改善作用，可能與激活Shh/Gli1信號通路密切相關。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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