基于SSR分子標記的新疆83個常規(guī)陸地棉品種親緣關(guān)系分析

關(guān)鍵詞：陸地棉；簡單重復(fù)序列（simplerepeated sequence，SSR）；分子標記；親緣關(guān)系；近似品種；群體結(jié)構(gòu)分析；主成分分析；多態(tài)性

棉花是新疆的重要經(jīng)濟作物。種子是農(nóng)業(yè)的“芯片”。在棉花種子方面，有幾個問題困擾著種業(yè)管理者和種植戶：一是品種同質(zhì)化。一些品種繁育停留在對主要推廣品種和核心親本的修飾改良上，導(dǎo)致品種遺傳基礎(chǔ)窄，審定品種多但突破性品種少[。二是假種子對種子市場的擾亂。“一名多品”“一品多名\"假種子現(xiàn)象[2]，導(dǎo)致育種企業(yè)效益的下降，種植戶對農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的預(yù)期無法達到。以上因素，對棉花品種的監(jiān)督管理和選擇利用造成了困擾，而明確各品種之間的親緣關(guān)系可以為品種的選擇和保護起到指導(dǎo)作用。

簡單重復(fù)序列（simple repeated sequence，SSR）分子標記因具有共顯性、多態(tài)性高、分型簡便快捷、成本低等優(yōu)點，被廣泛運用在品種遺傳多樣性分析、品種純度與真實性鑒定。在棉花中，李婧慧對由育種單位提供的150份新疆陸地棉品種進行聚類，發(fā)現(xiàn)新陸早棉花品種和新陸中棉花品種的相似系數(shù)分別為 0.5367～0.9936 和 0.503 1～0.987 7 ，表明150份新疆陸地棉品種間遺傳基礎(chǔ)較狹窄。權(quán)永剛等4用26對引物對自行收集的190份新疆棉花農(nóng)家品種進行了遺傳多樣性分析，香農(nóng)（Shannon）多樣性指數(shù)（ H^′ ）變幅為 0.922 1～2.043 5 ，表明在DNA水平存在一定的遺傳多樣性。李含笑對241份新疆已審定棉花品種進行鑒定與分析的結(jié)果表明，品種間相似系數(shù)為 0.267～0.853 ，表明這些棉花品種遺傳多樣性較高。以上對新疆棉花遺傳多樣性的研究表明，獲取樣品渠道不同，其研究結(jié)果也不盡相同。

本研究基于NY/T2634—2022《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》中所提供的引物，通過對新疆種業(yè)公司提供的83個常規(guī)棉品種進行遺傳多樣性分析，明晰其親緣關(guān)系和群體分類，為后期品種的鑒定和保護利用提供可靠依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

83份棉種樣品（表1）為2022一2024年由新疆各種業(yè)公司提供，引物來自NY/T2634一2022《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA的提取。每份樣品中隨機取70粒以上種子，充分磨碎后，取 200mg 左右粉末于 2.0mL 離心管，使用天根植物試劑盒（貨號：DP320-03）提取DNA，采用Implen超微量分光光度計N60Touch（德國）進行DNA質(zhì)量濃度的檢測。

表183份棉種樣品信息

表1 （續(xù)）

1.2.2 SSR標記檢測。根據(jù) NY/T2634-2022 《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》，使用60對SSR引物（由美國Thermofisher公司合成）對83份棉種樣品進行擴增。聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴增體系為 20μL ，包括 10μL 諾唯贊預(yù)混液（貨號P211-03）、 0.15μL 濃度為40μmol?L^-1 的引物 ?3μL DNA模板 ，6.85μL 雙重去離子水（ ）。PCR反應(yīng)程序為 94^°C 個循環(huán)； 72°C 7min 。

按照預(yù)先確定的組合引物，等體積取同一組合引物的擴增產(chǎn)物，充分混勻。從混合液中吸取 1μL 液體，加到DNA分析儀專用96孔上樣板上，使用 稀釋75倍，混勻。從稀釋液中吸取 1μL 液體，每孔再分別加入 0.15μL 分子量內(nèi)標物（Liz-500）和 8.85μL 去離子甲酰胺，混勻 1min ，離心 10s95^°C 變性 5min ，冷卻 10min 以上，瞬時離心 10s 后備用。使用3500基因分析儀（賽默飛公司）進行電泳檢測。使用GeneMapperTM軟件6讀取檢測數(shù)據(jù)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用農(nóng)作物SSR數(shù)據(jù)比對軟件（登記號：2025SR0343132）對樣品SSR數(shù)據(jù)位點進行兩兩比較。采用PowermarkerV3.25軟件分析SSR分子標記的等位基因數(shù)、多態(tài)性信息含量（polymorphisminformationcontent，PIC）。使用Structure2.3.4軟件評估群體結(jié)構(gòu)，設(shè)定亞群 K 為 _1～10 ，每個 K 值運行10次，參數(shù)Length of burn-in period設(shè)為 1.0× 10⁴ 次，MCMC（MarkovChainMonteCarlo）設(shè)為1.0×10⁵ 次，使用StructureSelector軟件確定最佳 K 值。使用GenALEx6.502進行主成分分析（princi-palcomponentanalysis，PCA）并繪制PCA圖。利用NTSYSpc-2.10e軟件計算棉種樣品的遺傳相似系數(shù)，并采用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA）進行聚類分析，最后使用ChiPlot軟件生成樹狀聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1 SSR標記多態(tài)性

根據(jù) 83 個品種的 SSR 數(shù)據(jù)， 對 60 個 SSR 標 記的等位變異數(shù)和 PIC 進行分析，結(jié)果見表 2。 60 對 SSR 引物共擴增出 153 個等位變異， 平均等位 變異數(shù)為 2.55， 其中引物 29 的等位變異最豐富（6 個）。60 對 SSR 引物的多態(tài)性信息指數(shù) PIC 變幅為 0.01～0.70，平均值為 0.32。 根據(jù)基因多樣性的 PIC 評判標準[7]：PIC≤0.25 的，為低度多態(tài)信息位點； 0.25＜PIC＜0.50 的， 是中度多態(tài)信息位點；PIC≥ 0.50 的，是高度多態(tài)信息位點。 按此分類，60 對引 物中 5 對引物含高度多態(tài)性信息位點，41 對引物 含中度多態(tài)性位點，14 對引物含低度多態(tài)性位點。

2.283份棉花品種SSR位點差異性分析

SSR位點差異數(shù)目在農(nóng)作物品種真實性鑒定中通常用來判定2個品種是否屬于同一個品種。根據(jù) NY/T2634-2022 《棉花品種真實性鑒定SSR分子標記法》規(guī)定，樣品間差異大于2，排除兩者為同一品種；樣品間差異點為1或2，不確定兩者為同一品種；樣品間差異位點數(shù)為0，不排除兩者屬于同一品種。在本研究中，83份品種兩兩比較共產(chǎn)生了3403個組合，差異位點范圍為 0～47 ，位點差異大于2的組合有3290個，占組合數(shù)的 96.7% （圖1）。 0～2 位點差異的組合有113個，涉及41個品種。其中：0位點差異的組合為27個，涉及27個品種；1或2位點差異的組合為86個，涉及37個品種。這意味著有41個品種的組合并不能排除兩者為不同品種，可能為同一品種。

表260個引物擴增效果

2.383份棉花品種聚類分析

2.3.1群體結(jié)構(gòu)分析。基于Structure2.3.4軟件的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，當 K=2 時， ΔK 出現(xiàn)峰值（圖2a），由此可以判定該群體可以分為2個群體（圖2b），群體pop1和pop2；當 K=3 時，群體popl并沒有發(fā)生變化，群體pop2分為pop2A和pop2B。樣本的親緣關(guān)系分析（圖2c）和主坐標聚類分析（圖2d）結(jié)果與群體結(jié)構(gòu)分析分類結(jié)果基本一致。2.3.2親緣關(guān)系分析。83份棉花品種的遺傳相似系數(shù)在 0.503～1.000 （圖3），平均值為0.690，其中有27份間遺傳相似系數(shù)為1.000，這說明83份棉種樣品遺傳背景較窄。

圖183個樣品SSR位點兩兩比較差異分布圖

2.3.3主坐標分析。83份棉種樣品中有早熟品種53份、早中熟品種30份。通常新疆南疆地區(qū)種植早中熟品種，而北疆地區(qū)種植早熟和特早熟品種。主坐標分析結(jié)果（圖2d）顯示，pop1共有樣品15份，均為早熟品種;pop2A共有樣品52份，其中包含早熟品種29份、早中熟品種23份;pop2B共有樣品16份，其中包含早熟品種9份、早中熟品種7份。由a.利用DeltaK估算最佳亞群數(shù)目;b.群體結(jié)構(gòu)圖;c.聚類圖;d.主坐標分析結(jié)果。

圖283個棉花品種群體結(jié)構(gòu)與聚類分析

圖383份陸地棉品種的SSR位點遺傳相似系數(shù)分布

此可見，這些品種并沒有明顯的地理分類特征。

3討論與結(jié)論

品種真實性鑒定是品種權(quán)保護的重要依據(jù)，其核心是對不同品種進行親緣關(guān)系分析。SSR標記對于判斷不同品種的親緣關(guān)系通常使用位點差異性和遺傳相似度，在品種真實性判斷中通常使用位點差異性8，而在衡量遺傳材料關(guān)系時使用遺傳相似度[9-10]。本研究中對83份棉種樣品SSR位點數(shù)據(jù)進行兩兩比對，發(fā)現(xiàn)0位點差異的組合27個，涉及27個品種，83份棉種樣品的遺傳相似系數(shù)也顯示有27個組合的相似系數(shù)為1.000。如果要進一步確定這些組合是否為同一品種，則須進一步進行田間小區(qū)種植鑒定。

在DNA分子層面對新疆陸地棉品種遺傳多樣性的持續(xù)研究中，其遺傳變異豐富還是狹窄的結(jié)論并不一致。葉春秀等[對41份北疆地區(qū)早熟陸地棉品種遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，其在遺傳距離為0.42時可劃分為3類，并認為其存在豐富的遺傳變異。而其他的研究結(jié)果則與之并不相同。楊永林等2對42份新疆陸地棉主栽品種的遺傳相似性分析發(fā)現(xiàn)，其遺傳相似系數(shù)在 0.71～0.97 。王輝等[13]對90份南疆陸地棉種質(zhì)資源遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，其遺傳相似系數(shù)在 0.58～0.84 ，且大部分種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)在0.7以上。王欣怡等[4對來自各育種單位的120個陸地棉品種的遺傳相似性分析發(fā)現(xiàn)，其遺傳相似系數(shù)范圍為 0.50～0.96 ，平均為0.73。以上研究顯示，新疆陸地棉遺傳相似系數(shù)偏高，遺傳差異較小，親緣關(guān)系較近。在本研究中，83份棉花品種的遺傳相似系數(shù)在 0.503～1.000 ，平均值為0.690，表明新疆陸地棉品種遺傳背景較狹窄。其原因是多方面的，其中之一是育種者對育種速度和品種單一性狀的追求，造成育種材料遺傳多樣性變窄[15]

吳玉珍等[2使用本研究中的60對引物對全國1015份棉花品種進行了鑒定分類，發(fā)現(xiàn)中國陸地棉分類結(jié)果具有明顯的地理分布特征。新疆陸地棉種植區(qū)按照天山山脈可以劃分為南疆和北疆植棉區(qū)，其中南疆為早中熟植棉區(qū)，北疆為早熟和特早熟植棉區(qū)。而本研究中83份棉種樣品的親緣關(guān)系分析、群體結(jié)構(gòu)分析和主成分分析分類結(jié)果基本一致，樣品被劃分為2個群體pop1和pop2，pop2包含pop2A和pop2B亞群，并沒有明顯的地理分類特征。隨著北疆氣候變暖[，早中熟品種跨區(qū)域銷售到北疆早熟植棉區(qū)成為可能。對差異位點為0的27個組合進一步分析，發(fā)現(xiàn)不同種植區(qū)域的8個品種組合互為相似性品種，涉及11個品種。這應(yīng)引起重視。

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（責任編輯：楊子山 責任校對：秦凡）