西藏桶裝水銅綠假單胞菌檢測與防控策略探討

Abstract： In this paper， according to GB 8538—2022， the detection and analysis of Pseudomonas aeruginosa in 6 batches of bottled drinking water submitted for testing in different cities in Xizang was carried out. The results showed that Pseudomonas aeruginosa was detected in 3 of the 6 batches of bottled drinking water， suggesting that relevant departments should strengthen monitoring to ensure the safety of drinking water.

Keywords： bottled drinking water; Pseudomonas aeruginosa; detection and analysis; prevention and contro strategies

銅綠假單胞菌是一種廣泛存在于自然環境中的革蘭氏陰性條件致病菌，又稱綠膿桿菌。對于免疫力低下的易感人群而言，其可能會引發一系列疾病，如導致肺功能下降、引發急性皮膚炎癥、誘發胃腸炎、導致腦膜炎，甚至引發敗血癥 [1-2]。由于其具有強大的環境適應能力、耐藥性以及致病性，成為食品安全和公共衛生領域的重要威脅。銅綠假單胞菌生長溫度為 25～42^°C ，最適生長溫度為 25～30^°C ，對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有較強的抵抗能力。對營養要求不高，在各類型水體中廣泛存在，因此常用來評價水體微生物的污染狀況[3]，成為桶裝飲用水質量檢驗中必不可少的重要指標之一。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品來源于西藏不同地市送檢的 6 批桶裝飲用水， 分 別 將 其 標 記 為 580、581、582、583、584、585，每批 5 桶，共計 30 份樣品（標記為 580-1、580-2、580-3 等），每份樣品均在保質期內且封樣完好。

1.2 試劑與儀器

津騰過濾系統、BPC-250 生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；BOT-1A 366 紫外觀察儀（北京中儀博騰科技有限公司）；假單胞菌選擇性培養基（CN）、乙酰胺肉湯、營養瓊脂培養基（北京陸橋技術股份有限公司）；陽性銅綠假胞菌（Pseudomonas aeruginosa）標準菌株 CICC21636、陰性 Pseudomonas aeruginosa 標準菌株 CICC20576（中國工業微生物菌種保藏中心）。

1.3 試驗方法

依據《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）對 6 批桶裝飲用水中銅綠假單胞菌進行檢測分析。無菌條件下，每桶取250mL 樣品，經孔徑為 0.45μm 親水性無菌微孔濾膜，將水中所含細菌截留富集在濾膜上，然后將濾膜移至 CN 瓊脂培養基上， 36°C 培養 20～48h 。將菌落在 CN 瓊脂上的生長狀態按表 1 進行確證性試驗 [4-5]。

2 結果與分析

2.1 平板分離結果

2.1.1 CN 瓊脂培養基生長結果

送檢的 6 批桶裝飲用水中，有 3 批次部分樣品（580-1、581-3、584-2）在 CN 瓊脂培養基上生長出可疑菌落，且在 366nm 紫外燈照射下可產生熒光，未見藍色、綠色、紅褐色菌落。銅綠假單胞菌因在CN 培養基上生長代謝產生綠膿菌素，菌落一般呈藍色或綠色，部分菌株分泌暗紅色素，使菌落形態呈紅褐色，亦有菌株代謝產生熒光素，在可見光下不表現顏色，但在 366nm 紫外燈照射下菌落呈現明顯的熒光現象 [4，6]。此實驗結果表明，所檢樣品中可能含有產熒光素但不產綠膿菌素的銅綠假單胞菌變種，或存在其他假單胞菌屬污染，按GB 8538—2022方法，要確證還需進一步驗證。

2.1.2 營養瓊脂 42°C 生長試驗結果

挑取 CN 瓊脂上發熒光的可疑單個菌落接種營養瓊脂培養基，于 36^°C 培養 24h ，進行純培養后，再將此純培養菌接種于營養瓊脂 42^°C 培養 ^48h ，同時，設陰性 Pseudomonas aeruginosa 對照和陽性Pseudomonas aeruginosa 對照，觀察營養瓊脂 42^°C 生長結果。結果表明，純培養菌、陽性對照在 42^°C 條件下培養，可見表面濕潤光滑，邊緣整齊，圓形，中心稍隆起，成“荷包蛋樣”，具有金屬光澤的灰白色小菌落，G 值 ?5 ，陰性對照 G 值 ?1 。提示該菌在此條件下生長良好，可以充分利用產生的熒光素幫助菌體在高溫低鐵環境中高效攝取鐵離子，從而適應高溫環境的生長繁殖。

2.2 生化試驗結果

取在 CN 瓊脂上發熒光菌落純培養物接種到乙酰胺液體培養基中，在 36°C 下培養 24h 。然后向每支試管培養物加入 1～2 滴鈉氏試劑，同時設陰性 Pseudomonas aeruginosa 對照和陽性 Pseudomonasaeruginosa 對照，10 s 內觀察試管的顏色變化，可見樣品組試管和陽性對照組試管由黃色變為磚紅色，顯示為陽性結果[5]；陰性對照組試管仍表現為清亮，無顏色變化。該試驗結果表明，純培養物中細菌可以利用作為唯一碳源和氮源的乙酰胺水解產生氨和乙酸，氨與鈉氏試劑反應生成磚紅色沉淀。

3 結論與討論

本次研究結果表明，待檢水中微生物在 CN 瓊脂上產生熒光性菌落、在 42°C 營養瓊脂上生長良好，提示可能存在銅綠假單胞菌。進一步進行生化試驗，發現待檢水中微生物能夠利用乙酰胺產生氨，與鈉氏試劑反應生成磚紅色沉淀，這是銅綠假單胞菌的典型生化特性之一，依據 GB 8538—2022 方法和判定標準，確認該菌存在。送檢的 6 批桶裝水中，有3 批的部分樣品出現了相同的實驗結果，表明 3 批桶裝水的部分樣品檢測出銅綠假單胞菌。

根據《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）和《食品安全國家標準 包裝飲用水》（GB 19298—2014），包裝飲用水中銅綠假單胞菌的限量要求為 n=5 、 c=0 、 m=0 （CFU/250mL ），即每批被檢的 5 份樣品中不允許任何一份樣品檢出銅綠假單胞菌。然而，實際檢測中發現部分樣品含有銅綠假單胞菌，而同批次的部分樣品未檢出，表明該菌在桶裝飲用水中的污染問題不容忽視，提示企業在生產過程中應加強對微生物污染指標的質量控制。同時，有研究表明，GB 8538—2022 方法對飲用水中銅綠假單胞菌的檢出靈敏度不高，約為1CFU/250mL ，而分子生物學方法如實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）的檢出靈敏度在 1～10CFU?mL^-1 ，生物傳感器技術靈敏度為 1CFU?mL^-1 ，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜檢出靈敏度為 10²CFU?mL^-1 。但這些檢測方法存在檢測成本較高，難以普及等局限。因此，采用 GB 8538—2022、GB 19298—2014 中的方法檢測飲用水中銅綠假單胞菌時可通過增加檢測次數和稀釋倍數提高樣品的陽性檢出率和檢測靈敏度。

表1 菌落在 CN 瓊脂上的生長狀態及確證性試驗

注：NT 表示不用試驗； + 表示進行相應實驗。

銅綠假單胞菌作為一種常見的條件致病菌，廣泛存在于自然界，尤其在桶裝飲用水的生產過程中，由于其生長環境的適宜性，容易造成污染。針對銅綠假單胞菌的污染問題，本文提出以下對策。 ① 做好水源水的選擇與保護。應優先選擇優質地下水或未受污染的地表水作為水源，并對水源地的水質進行全面檢測和評估，監測指標包括微生物指標、化學指標等，確保水源符合桶裝飲用水的生產要求。同時要加強水源地的保護，禁止在其周圍進行工業生產、農業種植、養殖等活動，避免工業廢水、生活污水、農業用水對水源的影響，防止水源污染。此外，還要加強對水源地周邊環境的監測和管理，定期對水源地的水質進行檢測，及時發現和處理可能存在的污染問題，有效防控銅綠假單胞菌對其的污染。 ② 加強生產過程中的防控措施，優化生產工藝，采用多級過濾、反滲透等技術，去除水中的雜質、微生物和重金屬等有害物質。同時要定期對生產設備和管道進行清洗和消毒，一般來說，先用清水沖洗設備和管道，去除表面的污垢和雜質，然后用消毒劑進行浸泡或循環消毒，消毒劑的濃度和作用時間應根據設備和管道的材質、污染程度等因素進行合理選擇。消毒完成后，再用清水沖洗干凈，確保消毒劑無殘留。生產設備、管道清洗和消毒是防止銅綠假單胞菌滋生的重要措施。在灌裝環節，應采用紫外線消毒、臭氧消毒等技術對桶裝水進行終端消毒，殺滅水中可能存在的細菌，確保灌裝設備的密封性良好，避免空氣中的細菌進入桶裝水中，切實有效降低桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染風險。有研究表明，加強灌裝環節水源水的消毒處理，在水處理過程中增加紫外線殺菌裝置，利用其廣譜殺菌能力能有效殺滅水體中的銅綠假單胞菌 [7-9]；提升灌裝車間的空氣潔凈度，定期對車間的地面、墻壁、天花板等進行清潔和消毒，使用有效的消毒劑進行噴灑或擦拭，定期維護空氣過濾裝置，控制車間內的溫度和濕度，一般溫度應控制在 18～25^°C ，濕度控制在 40%～60% 。確保空氣潔凈度達到規定標準，防止銅綠假單胞菌通過氣溶膠污染傳播 [10]。③ 加強人員衛生知識培訓管理，確保操作人員嚴格遵守衛生操作規程，穿戴潔凈的工作服、手套和口罩，定期進行健康檢查，避免將細菌帶入生產過程中 [11-12]。 ④ 建立一套全面、有效、多層次的檢測、監測體系，包括飲用水生產企業的內部檢測監測、環境影響評估、監管部門的監督檢查、食品安全監督抽檢，以及相關技術機構的技術指導、安全性評估等，確保飲用水在生產、流通過程不會受到污染[13]。

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