基于PCR技術(shù)快速檢測(cè)食品中的常見致病菌

Abstract： Objective： To establish a method based on polymerase chain reaction （PCR） to quickly and accurately detect common pathogens in food. Method： Escherichia coli O157：H7， Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes were selected as target pathogens， and primers were designed for their specific genes. The simulated contaminated food samples were tested and compared with the traditional culture detection method. Result： The PCR method can specifically amplify the target pathogen genes with a sensitivity of up to 10²CFU?mL^-1 ， and the detection time is shortened from 3 to 5 days of the traditional method to 6 to 8 hours. Conclusion： In actual food testing， the PCR method has a higher compliance rate than the traditional method， which provides effective technical support for the rapid detection of food microbial safety.

Keywords： PCR technology; food microbiology; pathogen detection; quick detection

食品安全問題一直是全球關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其是由微生物污染導(dǎo)致的食源性疾病頻發(fā)，嚴(yán)重威脅人類健康 [1-2]。常見的食源性致病菌如大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌，可通過受污染的食品進(jìn)入人體，引發(fā)腹瀉、嘔吐、敗血癥等嚴(yán)重病癥。傳統(tǒng)的食品微生物檢測(cè)方法主要依賴于微生物的培養(yǎng)、生化鑒定等步驟，雖然結(jié)果可靠，但操作煩瑣、耗時(shí)較長，一般需要 3 ～ 5 d 才能得出檢測(cè)結(jié)果，難以滿足現(xiàn)代食品行業(yè)的快速檢測(cè)需求以及在食品安全突發(fā)事件中的應(yīng)急檢測(cè)要求。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)是一種體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高效等優(yōu)點(diǎn) [3-4]。通過設(shè)計(jì)針對(duì)目標(biāo)微生物特異性基因的引物，可在短時(shí)間內(nèi)將微量的目標(biāo)DNA 擴(kuò)增數(shù)百萬倍，便于檢測(cè)和分析。近年來，PCR 技術(shù)在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，為快速檢測(cè)食品中致病菌提供了新的技術(shù)手段。本研究旨在建立基于 PCR 技術(shù)檢測(cè)食品中常見致病菌的方法，并與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估其在實(shí)際食品檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的牛奶、雞肉、蔬菜等，購自當(dāng)?shù)爻小?/p>

DNA 提取試劑盒，北京百奧萊博科技有限公司；PCR 擴(kuò)增試劑盒（含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、緩沖液等）、DNA Marker，北京百奧萊博科技有限公司；引物，金斯瑞生物科技公司；瓊脂糖，廣州威佳科技有限公司；溴化乙錠，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

大腸桿菌 O157：H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購自中國微生物菌種保藏管理中心，實(shí)驗(yàn)前將菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 37°C 培養(yǎng)18～24h ，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

T100PCR 擴(kuò)增儀、Gel Doc EZ 凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂；5810R 高速離心機(jī)，德國 Eppendorf；DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠；CB60 恒溫培養(yǎng)箱，德國 Binder；HVA-110 高壓滅菌鍋，日本Hirayama。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PCR 方法的建立與驗(yàn)證

（1）引 物 設(shè) 計(jì)。 根 據(jù) GenBank 中 大 腸 桿 菌O157：H7 的 rfbE 基 因、 金 黃 色 葡 萄 球 菌 的 nuc 基因和單增李斯特菌的 hlyA 基因序列，利用 PrimerPremier 5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)原則：引物長度為 18～25bp ，GC 含量為 40%～60% ，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。引物序列及相關(guān)信息如表 1 所示。

（2）DNA 提取。采用 DNA 提取試劑盒分別提取 3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株及模擬污染食品樣本中的 DNA。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，提取后的 DNA 于-20°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）PCR 擴(kuò)增。在 0.2mL PCR 反應(yīng)管中依次加入以下反應(yīng)體系： 10×PCR 緩沖液 2.5μL 、dNTPs（ 2.5mmol?L^-1 ） 2μL 、上下游引物（ ）各1μL 、Taq DNA 聚 合 酶（ 5U?μL^-1 ） 0.25μL 、 模 板 ，用 補(bǔ)足至 25μL 。PCR 擴(kuò)增條件：95^°C 預(yù)變性 5min ； 95°C 變性 30s ， 55^°C 退火 30s ，72°C 延伸 30s ，共35 個(gè)循環(huán)； 72^°C 終延伸 10min 。

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)。取 5μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與1μL6× 上樣緩沖液混合后，進(jìn)行 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。電泳條件：電壓 120V ，時(shí)間 30～40min 。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照記錄，與DNA Marker 對(duì)比判斷擴(kuò)增片段大小。

（5）靈敏度實(shí)驗(yàn)。將 3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別進(jìn)行梯度稀釋，制備成濃度為 10⁶ 、 10⁵ 、 10⁴ 、 10³ 、 10² 、10¹CFU?mL^-1 的菌懸液，提取 DNA 后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)各濃度下的擴(kuò)增情況，確定該方法的檢測(cè)靈敏度。

（6）特異性實(shí)驗(yàn)。除目標(biāo)致病菌外，選取其他常見的非目標(biāo)微生物如枯草芽孢桿菌、乳酸菌等，提取其DNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，驗(yàn)證引物的特異性。

1.3.2 模擬污染食品檢測(cè)

將 3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株分別以不同濃度（ 10³ 、 10⁴ 、10⁵CFU?mL^-1 ）接種于牛奶、雞肉、蔬菜等食品樣本中， 37°C 孵育 4～6h 后，按照上述方法提取 DNA并進(jìn)行 PCR 檢測(cè)，同時(shí)與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法對(duì)比。傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法按照GB 4789系列國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，包括增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等步驟。

1.3.3 實(shí)際食品樣本檢測(cè)

采集當(dāng)?shù)爻械呐Ｄ獭⑷庵破贰⑹卟说炔煌愋偷氖称窐颖竟?50 份，分別采用 PCR 方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估PCR 方法在實(shí)際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以 3 種標(biāo)準(zhǔn)菌株 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，在預(yù)期位置分別出現(xiàn)了長度為 250bp （大腸桿菌 O157：H7）、150bp （金黃色葡萄球菌）和 300bp （單增李斯特菌）的特異性條帶，與理論擴(kuò)增片段長度一致，而陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)，表明 PCR 擴(kuò)增成功，引物具有特異性。

2.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株 DNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明該方法對(duì)大腸桿菌 O157：H7、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的檢測(cè)靈敏度均可達(dá)到10²CFU?mL^-1"。當(dāng)菌液濃度低于 10²CFU?mL^-1"時(shí)，擴(kuò)增條帶逐漸減弱甚至消失。

表1 大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌引物

2.3 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以非目標(biāo)微生物 DNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示均未出現(xiàn)特異性條帶，表明設(shè)計(jì)的引物僅對(duì)目標(biāo)致病菌具有特異性擴(kuò)增能力，不會(huì)與其他非目標(biāo)微生物發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.4 模擬污染食品檢測(cè)結(jié)果

在模擬污染食品檢測(cè)中，PCR 方法能夠快速檢測(cè)出接種的目標(biāo)致病菌，從樣本處理到得出檢測(cè)結(jié)果僅需 6～8h 。而傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法需要經(jīng)過增菌、分離培養(yǎng)、生化鑒定等多個(gè)步驟，整個(gè)檢測(cè)過程需要 3～5d 。如表 2 所示，針對(duì)不同濃度的模擬污染食品樣本，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均為陽性，表明 PCR 方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法都能有效地檢測(cè)出目標(biāo)致病菌，PCR 方法在準(zhǔn)確性上與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相當(dāng)。

表2 PCR 方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法對(duì)模擬污染食品的檢測(cè)結(jié)果

2.5 實(shí)際食品樣本檢測(cè)結(jié)果

對(duì) 50 份實(shí)際食品樣本進(jìn)行檢測(cè)，PCR 方法檢測(cè)出陽性樣本8 份，其中大腸桿菌O157：H7 陽性2 份，金黃色葡萄球菌陽性3 份，單增李斯特菌陽性3 份；傳統(tǒng)培養(yǎng)方法檢測(cè)出陽性樣本 7 份，其中大腸桿菌O157：H7 陽性2 份，金黃色葡萄球菌陽性2 份，單增李斯特菌陽性 3 份。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果符合率為96% （48/50）。

對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不一致的樣本，進(jìn)一步采用測(cè)序等方法進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) PCR 方法檢測(cè)出的 1 份金黃色葡萄球菌陽性樣本為假陽性，可能是由于樣本中存在與引物序列相似的非目標(biāo) DNA 片段，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

3 討論與結(jié)論

本研究成功建立了基于 PCR 技術(shù)檢測(cè)食品中常見致病菌大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌的方法。該方法具有良好的特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出食品中的目標(biāo)致病菌，檢測(cè)靈敏度可達(dá) 10²CFUmL^-1 ，滿足食品微生物檢測(cè)的要求，為食品微生物安全檢測(cè)提供了一種可靠的技術(shù)手段。

與傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法相比，PCR 技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì) [5]。PCR 技術(shù)檢測(cè)速度快，從樣本處理到得出結(jié)果僅需 6～8h ，大大縮短了檢測(cè)周期，能夠滿足食品生產(chǎn)企業(yè)快速檢測(cè)和食品安全監(jiān)管部門應(yīng)急檢測(cè)的需求；操作相對(duì)簡(jiǎn)便，無須復(fù)雜的微生物培養(yǎng)和生化鑒定步驟，減少了人為誤差和污染的可能性；具有較高的靈敏度和特異性，能夠檢測(cè)出低濃度的目標(biāo)致病菌，且不易受到其他微生物的干擾 [6]。

隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，PCR 技術(shù)有望在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用，為保障食品安全提供有力支持。在今后的研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化 PCR 檢測(cè)體系，探索更加高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，同時(shí)加強(qiáng)對(duì)實(shí)際食品樣本的檢測(cè)研究，不斷提高檢測(cè)技術(shù)的實(shí)用性和可靠性。

參考文獻(xiàn)

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