免疫親和柱凈化- 液相色譜- 激光誘導- 熒光光譜法測定食用油中4種黃曲霉毒素含量

Abstract： Objective： To establish an instrumental analysis method for the determination of aflatoxins B₁ （AFT B₁^′ ）， aflatoxin B₂ （AFT B_2，^? ， aflatoxin G₁ （AFT G₁^′ ） and aflatoxin G₂（AFTG₂） in edible oil by immunoaffinity column cleanupliquid chromatography-laser induced fluorescence spectrometry， and to determine these four aflatoxins in edible oil samples to provide a basis for evaluating their quality. Method： The samples were separated by Immunoaffinity column and analyzed by laser induced fluorescence spectrometry after filtration. Result： AFT B₁ and AFT G₁ showed good linearity in the concentration range of 0.2ng?mL^-1 to 50.0ng?mL^-1 ， and AFT B₂ and AFT G₂ showed good linearity in the concentration range of 0.06ng?mL^-1 to 15.00ng?mL^-1 . The spiked recovery of the samples is between 90.7% and 107.0% ， and the relative standard deviation is between 0.61% and 7.49% . Conclusion： This method has high sensitivity and good accuracy， and meets the requirements for the detection of aflatoxins in edible oils.

Keywords： aflatoxin; edible oil; laser Induction; fluorescence spectroscopy

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的一組化學結構類似的劇毒性次級代謝產物，屬于二氫呋喃香豆素衍生物，其中以黃曲霉毒素 B₁ （Aflatoxins B₁ ）、黃曲霉毒素 B₂ （AflatoxinsB₂ ）、黃曲霉毒素 G₁ （Aflatoxins G₁ ）和黃曲霉毒素G₂ （Aflatoxins G₂ ）最為常見，對人類及動物健康構成嚴重威脅，具有強烈的致癌性、致畸性和致突變性。食用油作為重要的日常膳食組成部分，其質量安全直接關乎消費者的健康，因此各國均制定了嚴格的食品中黃曲霉毒素含量監管標準[1]。目前，黃曲霉毒素的傳統檢測方法主要有薄層色譜法[2]、酶聯免疫吸附法 [3]、高效液相色譜 - 熒光光譜檢測法 [4-5] 和超高效液相色譜- 質譜法[6]。近年來，新型檢測裝置，如三通道發光二極管誘導熒光檢測器[7]，激光誘導熒光技術 [8] 的研發進一步拓展了檢測手段。然而，食用油基質中復雜成分的干擾常導致傳統方法的靈敏度和特異性顯著降低，尤其在痕量毒素分析中易出現假陽性或假陰性結果[9]。針對上述問題，本文提出一種基于免疫親和柱凈化 - 液相色譜 - 激光誘導熒光光譜聯用的高靈敏檢測方法，通過優化前處理流程與激發波長參數，系統驗證該方法對食用油中 AFTB₁ 、AFT B₂ 、AFT G₁ 和 AFT G₂ 的檢測性能，旨在為復雜基質中毒素精準分析提供高效可靠的技術方案，助力食品安全監管體系的技術升級。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈（色譜純），默克股份兩合公司；氯化鈉（分析純），廣州化學試劑廠；黃曲霉毒素混合標準溶液 [AFT B₁ （ 2.0μg?mL^-1 ）、AFT B₂ （ 0.5μg?mL^-1 ）、AFT G₁ （ 2.0μg?mL^-1 ） 和 AFT G₂ （ 0.5μg?mL^-1 ）]，青島普瑞邦生物工程有限公司；實驗用水符合《分析實驗室用水規格和試驗方法》（GB/T 6682—2008）規定的一級水；黃曲霉毒素 B₁ 快速檢測試紙條。

1.2 儀器與設備

勻漿機，上海安譜實驗科技有限公司；渦旋振蕩器，艾卡（廣州）儀器設備有限公司；天平（感量0.01g ），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；離心機：轉速 ?8 000r?min^-1 ，上海安亭科學儀器廠；固相萃取裝置（帶真空泵），北京優晟聯合科技有限公司；氮吹儀，上海安譜實驗科技有限公司；液相色譜儀（配激光誘導熒光檢測器），廣州譜臨晟科技有 限 公 司；Alphasil VC-C₁₈ 液相色譜柱（ 150mm^× 4.6mm ， 5μm ），華譜科儀（北京）科技有限公司；免疫親和柱，上海安譜實驗科技有限公司；一次性微孔濾頭（帶 0.22μm 微孔濾膜），上海安譜實驗科技有限公司。

1.3 標準溶液的配制

① 混合標準工作溶液。分別移取 AFT B₁ 和AFTG₁2.5mL ，AFT B₂ 和 AFT G₂ 3mL 至 10mL 容量瓶中，乙腈定容。 ② 標準系列工作溶液。分別準確移取混合標準工作溶液 4、10、20、40、100、200、 500μL 和 1000μL 至 10mL 容量瓶中。用初始流動相溶液定容至刻度線，得到 AFT B₁ 和 AFT G₁ 濃 度 分 別 為 0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、25.00ng?mL^-1 和 50.00ng?mL^-1 ，AFT B₂ 和 AFT G₂ 濃 度 分 別 為 0.06、0.15、0.30、0.60、1.50、3.00、7.50ng?mL^-1 和 15.00ng?mL^-1 的系列標準溶液。

1.4 樣品測定

① 樣品處理。參照《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素 B 族和 G 族的測定》（GB 5009.22—2016） ^[10]5.2.1.1 對樣品進行處理。 ② 凈化。取出黃曲霉毒素 B₁ 免疫親和柱，恢復至室溫（ 22～25^°C ），將上端塞子取出，打開下端堵頭，將柱內保存液流掉至高于凝膠上界面 3～5mm 處，停止流液。 ③ 加樣。加入處理好的樣品溶液過柱，打開下端堵頭，調節流速至每秒 ψ₁～ψ₂ 滴，棄去流出液。加處理好的樣品 15mL 。液體徹底排凈后，用 10mL 蒸餾水淋洗2 次，棄去流出液。 ④ 吹干。用吸耳球壓入空氣，將柱子中的水吹干。 ⑤ 洗脫。加入 1mL 甲醇（色譜級），調節流速為每秒 2 ～ 3 滴，緩慢洗脫，收集全部洗脫液即為凈化后的樣品，凈化后的樣品可直接用快速檢測試紙條及液相色譜激光誘導熒光光譜法檢測。

1.5 儀器條件

① 色 譜 條 件。 色 譜 柱 Alphasil VC-C₁₈ 柱（ 150mm×4.6mm，5μm ）；流動相為甲醇∶乙腈∶水，體積比為 16：16：68 ；洗脫條件：等度洗脫；流速：1.0mLmin^-1 ；柱溫： 40°C ；進樣量： 15μL ；運行時間：28min 。 ② 熒光光譜條件。激發波長： 375nm ；發射波長： 450nm 。

2 結果與分析

2.1 檢測條件優化

2.1.1 基線噪聲與漂移

熒光檢測系統的背景噪聲主要由流通池光學界面產生的激發光折射 / 反射效應、流動相中雜質離子誘導的瑞利散射以及光電轉換模塊的電路本底噪聲這 3 方面引起 [11]。根據《液相色譜儀檢定規程》（JJG 705—2014）[12] 和《高 效 液 相 色 譜 儀》（GB/T 26792—2019）[13] 技 術 要 求， 基 線 噪 聲（以峰對峰法計算）與基線漂移（單位時間內基線極差）是評價檢測器穩定性的關鍵參數 [14-15]，其數值直接關聯儀器檢測限與定量重復性。實驗采用甲醇∶乙腈∶水體積比為 16：16：68 為流動相體系，通過標準測試程序測得基線噪聲值為 299.2 count。進一步考察預熱時長對系統穩定性的影響發現，當預熱時間從 30min 延長至 60min 時，基線漂移值由54 631.6 count 明顯降低至 2 536.9 count（圖 1），降幅達 95.4% 。盡管不同預熱時段的基線噪聲波動范圍相近（ 30min ：299.2 count； 60min ：286.5 count），但基線漂移呈現數量級差異，表明充分預熱可通過熱平衡機制有效抑制光源模塊的時域波動，從而提升系統長期運行穩定性。

圖1 檢測器基線噪聲和漂移測試色譜圖（ ）

2.1.2 色譜信號平滑處理優化

為降低基線噪聲對定量分析的干擾，采用Savitzky-Golay 算法對檢測器原始信號進行平滑處理 [16]。由圖 2 可知，檢測器采集的色譜信號經過不同數據點數量的平滑處理，隨著平滑點數的增加，數據越平滑，基線噪聲越平整，色譜峰強度及位置基本保持不變，不影響整個色譜的積分面積。表明該參數設置既可有效抑制隨機噪聲，又能保持色譜峰形完整性。基于信噪比改善效率與峰形畸變風險的權衡，最終選擇平滑20 個點作為最優平滑窗口寬度。

圖2 色譜信號平滑處理對比圖

2.2 方法建立

2.2.1 標準曲線的建立

在 1.5 項色譜條件下對系列標準溶液進樣測定，分別以峰面積為縱坐標，黃曲霉毒素濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程見表 1。當 AFT B₁ 和 AFTG₁ 在 0.20～50.00ng?mL^-1 時，AFT B₂ 和 AFT G₂ 在0.06～15.00ng^.mL^-1 時， R² 均大于 0.999，說明線性關系良好。本熒光檢測器在相同測試條件下的線性范圍為 0.06～50.00ng/mL^-1 ，與市售同類產品 [17]的性能水平相近，表明其在痕量毒素分析中具有實際應用潛力。以色譜峰峰高信噪比 S/N?3 為方法檢出限， S/N?10 為方法定量限，表明該方法的檢測限滿足《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素 B 族和 G 族的測定》（GB 5009.22—2016）的要求 [10]。

2.2.2 回收率和精密度

通過加標回收實驗來驗證方法準確性，計算其回收率，結果如表2 所示。黃曲霉毒素加標回收率在90.7%～ 107.0% ，相對標準偏差（Relative StandardDeviation，RSD）在 0.61%～7.49% 。結果表明該實驗方法準確可靠，可用于黃曲霉毒素 B 族和 G 族的檢測。

2.3 實際樣品檢測

對食用油樣品進行快速篩選，結果如圖3 所示。將陽性樣品進行復核檢測，得到實際樣品色譜圖（圖4），結果顯示樣品對黃曲霉毒素的檢測無干擾，在所檢的商品花生油樣本中未檢出黃曲霉毒素，但在自榨花生油樣品中檢出 AFT B₁ 、AFT B₂ ，可能原因為自榨花生未將霉變花生剔除干凈且榨油后未經過后續處理。這與李亞等 [18]，梁馨予等 [19] 關于小作坊花生油黃曲霉毒素風險的研究結論一致，進一步證實完善原料篩選與加工工藝對控制食用油安全的關鍵作用。

從左到右依次是自榨花生油、商品花生油 1、商品花生油 2和商品花生油3。

表1 標準曲線線性方程、方法檢出限和定量限

表2 加標回收結果（ （n=3 ，單點外標法）

圖3 實際樣品AFT B₁"快速檢測試紙條結果

圖4 實際樣品色譜圖

3 結論

本研究成功構建了一種基于免疫親和柱凈化 -液相色譜 - 激光誘導熒光光譜聯用儀用于測定食用油中 AFT B₁ 、AFT B₂ 、AFT G₁ 和 AFT G₂ 含量的檢測方法。在 0.06～50.00ngmL^-1 時， R² 均大于 0.999，說明線性關系良好。4 種黃曲霉毒素加標回收率在90.7%～ 107.0% ，相對標準偏差在 0.61%～7.49% ，該方法具有操作簡便、設備使用維護成本低、靈敏度高和重現性好等優點，有望滿足食品監管部門實驗室對高效分析方法的需求。

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