蘿卜硫素和天然低共熔溶劑協同抗氧化作用研究

Abstract： The study investigated the individual and synergistic antioxidant activities of sulforaphane and natural deep eutectic solvents in scavenging 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and ^2，2° -azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt （ABTS） radicals in vitro. By establishing a cellular oxidative damage model， their effects on glutathione （GSH） content， catalase （CAT） and superoxide dismutase （SOD） in oxidatively damaged cells were evaluated. The results demonstrated that sulforaphane and natural deep eutectic solvents exhibited synergistic enhancement in scavenging DPPH and ABTS radicals. At the cellular level， sulforaphane and natural deep eutectic solvents synergistically increased GSH levels and CAT， SOD activities， thereby reducing cellular oxidative damage.

Keywords： sulforaphane; natural deep eutectic solvents; antioxidant; synergistic effect

蘿卜硫素（Sulforaphane，SF）是十字花科蔬菜中普遍存在的一種異硫氰酸酯類化合物，是由硫代葡萄糖苷在內源性黑芥子酶作用下水解形成[1]。蘿卜硫素具有抗氧化、抗腫瘤、抗肥胖、降糖及預防神經系統疾病等多種生物學活性[2]。目前，在天然活性成分的抗氧化研究中，研究重點已經不再限于單一組分對機體的影響，而是轉向多組分復合交互影響的研究。已有研究表明，許多天然抗氧化劑相互影響，其協同效應使得復合使用優于單一組分，組分間具有協同抗氧化效果[3]。抗氧化劑和天然存在的分子可以形成低共熔溶劑，作為氫鍵供體或氫鍵受體，產生具有抗氧化活性的天然低共熔溶劑[4]。天然低共熔溶劑與活性成分復合不僅能提高其生物活性，還能提高其溶解度與生物利用度 [5]。KONGPOL 等 [6] 研究疏水性低共熔溶劑和姜黃素類化合物組合對 RAW264.7巨噬細胞的抗炎作用，發現疏水性低共熔溶劑可以增強化合物的抗炎特性并最大限度地減少細胞毒性。KHORSANDI 等 [7] 通過黑色素瘤細胞試驗發現，一些基于膽堿的低共熔溶劑具有非常低的毒性和較高的生物相容性。UKA 等 [8] 將白藜蘆醇溶解于天然低共熔溶劑，增強了白藜蘆醇的溶解度并提高了其抗氧化活性和穩定性。

目前，關于天然低共熔溶劑與活性成分協同抗氧化性的研究主要集中在天然低共熔溶劑提取物方面，而天然低共熔溶劑直接與活性成分復合使用的研究較少。因此，本文對蘿卜硫素和天然低共熔溶劑單獨或協同作用的體外抗氧化效果進行了研究，并建立了 HepG2 細胞氧化損傷模型，研究兩者對細胞氧化損傷保護的協同效應。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘿卜硫素、薄荷醇、叔丁基過氧化氫（Tert-Butyl Hydroperoxide，TBHP）、二甲基亞砜（DimethylSulfoxide，DMSO）、1，1- 二 苯 基 苦 基 苯 肼（1，1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH），購于上海麥克林生化科技股份有限公司；2，2’- 聯氮基雙 -（3- 乙基苯并噻唑啉 -6- 磺酸 ） 二銨鹽 [2，2’-Azino-Bis（3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid） DiammoniumSalt，ABTS]，購于上海源葉生物科技有限公司；肉桂醇、茴香醇，購于上海阿拉丁生物技術公司；過硫酸鉀，購于國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清，購于 Gibco 公司；細胞增殖與毒性檢測試劑盒（CCK-8），購于蘭杰柯科技有限公司；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）檢測試劑盒、還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）檢測試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Series Ⅱ WATER JACKET 二氧化碳培養箱、Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀、Super-NuovaTM 多點數字加熱磁力攪拌器，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；SW-CJ-1FD 單人單面垂直凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 天然低共熔溶劑的制備

參考 FAN 等 [9] 方法，選擇肉桂醇∶茴香醇（Cinnamyl alcohol Ψ：Ψ Fenchyl alcohol，CiFe）和 肉 桂醇∶薄荷醇（Cinnamyl alcohol σ：σ Menthol，CiMe）兩種天然低共熔溶劑用于后續實驗研究。兩種天然低共熔溶劑分別按照 1：2 的摩爾比混合，在 70^°C 磁力攪拌加熱 2h ，直至形成均勻透明的溶液備用。

1.3.2 SF 和天然低共熔溶劑體外抗氧化活性的測定

DPPH 自由基清除率測定采用LV 等[10] 的方法。ABTS 自由基清除率測定采用ZOU 等 [11] 的方法。

1.4 HepG2 細胞氧化損傷保護作用

1.4.1 HepG2 細胞培養

取凍存的 HepG2 細胞，置于 37°C 恒溫水浴鍋中快速解凍，將解凍后的細胞懸浮于含 10% 胎牛血清和 1% 青 - 鏈霉素雙抗混合液的最低必須培養基（Minimum Essential Medium，MEM）中，均勻鋪于培養皿中。在含 5% CO₂ 、 37°C 的飽和濕度細胞培養箱中培養。

1.4.2 不同濃度 SF 對 HepG2 細胞存活率的影響

選 擇 處 于 對 數 生 長 期 的 HepG2 細 胞， 以1×10⁵ 個 /mL 的密度接種于 96 孔細胞培養板中，每孔 0.1mL ， 37^°C 培養 24h ，棄上清，分別加入含不同濃度 SF 的 MEM 培養基 0.1mL ， 24h 后測定細胞活力。對照組不含SF。

1.4.3 SF- 天然低共熔溶劑對 HepG2 細胞存活率的影響

細胞培養方法同 1.4.2，作用的藥物為 SF、CiFe-SF、CiMe-SF、CiFe、CiMe。將 SF 分別溶于DMSO、CiFe、CiMe 中，制備成濃度為 100mmol?L^-1 的母液，用 MEM 稀釋至 10μmol?L^-1 ，培養基中DMSO 最終濃度 lt;0.1% ， 24h 后進行細胞活力測定。

1.4.4 構建 TBHP 誘導 HepG2 細胞損傷模型

細胞培養方法同 1.4.2，作用的藥物為 TBHP。使用 MEM 培養基將 TBHP 稀釋至 100、200、300、400、 ，每孔加入造模液 0.1mL ， 37°C 培養 2h 后檢測細胞存活率。

1.4.5 細胞分組及給藥方式

選擇處于對數生長期的 HepG2 細胞，常規培養24h 后進行分組處理。對照組（Control）：棄去含血清的培養液上清，加入不含血清的 MEM 培養液培養26h ；模型組（Model）：棄培養液，加入不含血清的MEM 培養液培養 24h ，之后棄培養液，加入含終濃度為 400μmol?L^-1 的 TBHP 培養液損傷處理 ^2h ；樣品組：棄培養液，分別加入含終濃度為 的 SF、CiFe-SF、CiMe-SF 或 不 含 SF 的 CiFe、CiMe 培養液培養 24h ，之后棄培養液，加入含終濃度為 400μmol?L^-1 的 TBHP 培養液處理 2h 。

1.4.6 細胞內 GSH、SOD、CAT 含量檢測

取處于對數生長期的細胞，按上述分組處理后，參照試劑盒說明書步驟嚴格操作，測定 GSH、SOD、CAT 的水平。

1.4.7 數據統與分析

使用 GraphPad Prism 10 軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。數據以“平均數 ± 標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化能力研究

為了探究 SF- 天然低共熔溶劑復合物形成前后的抗氧化能力，檢測了不同樣品的 DPPH 和 ABTS自由基清除活性。如圖 1 所示，CiFe 和 CiMe 的DPPH 自由基清除率為 33% 和 18% ，顯著優于 SF（ 3% ）。 同 樣，CiFe 和 CiMe 的 ABTS 自 由 基 清 除率為 21% 和 31% ，顯著優于 SF（ 2% ）。SF 自由基清除率較低可能是因為其通過激活核轉錄相關因子2/ 抗氧化反應元件（Nuclear Factor Erythroid 2-relatedFactor 2/Antioxidant Response Element，Nrf2/ARE）信號通路，刺激機體生成谷胱甘肽等抗氧化酶，間接起到抗氧化作用，而非直接清除自由基 [12]。值得注意 的 是， 與 CiFe 和 CiMe 相 比，CiFe-SF 和 CiMe-SF 自由基清除率顯著提高。研究發現，一些低共熔溶劑成分可以提高提取物的抗氧化活性，這表明低共熔溶劑與可溶性化合物之間可能存在協同抗氧化作用 [4，13]。肉桂醇、茴香醇、薄荷醇具有抗氧化活性 [14-16]，有助于提高 SF 的抗氧化活性。

2.2 不同濃度 SF 對 HepG2 細胞的細胞毒性

如圖 2 所示，以含有 0.1% DMSO 的 MEM 培養基作為空白組，細胞存活率為 100% 。與空白組相比，在 ，隨著 SF 濃度的增加，HepG2細胞的存活率逐漸下降， 10μmol?L^-1 存活率高于90% ，因此選擇 10μmol?L^-1 的 SF 進行后續實驗。

2.3 SF- 天然低共熔溶劑對 HepG2 細胞存活率的影響

利 用 CCK-8 法， 采 用 SF、CiFe、CiMe、CiFe-SF、CiMe-SF處理HepG2細胞 24h ，進行細胞毒性分析。由圖 3 可知，CiFe-SF 與 CiMe-SF 處理 HepG2 細胞存活率均在 90% 以上，與單一使用 SF 處理 HepG2細胞存活率相似，且 CiFe 與 CiMe 處理 HepG2 細胞存活率均在 100% 左右，表明這兩種天然低共熔溶劑對HepG2 細胞沒有毒性。

圖1 SF- 天然低共熔溶劑對DPPH、ABTS 自由基的清除率

上標字母不同表明組間差異顯著（ plt;0.05 ），下同。

圖2 不同濃度SF 對HepG2 細胞存活率的影響

圖3 SF- 天然低共熔溶劑對HepG2 細胞存活率的影響

2.4 構建 TBHP 誘導 HepG2 細胞氧化損傷模型

在建立細胞損傷模型時，細胞存活率是直接反映外界環境因素對細胞損傷程度的關鍵指標。正常情況下，細胞存活率為 50%～70% 時，表明外界環境因素已對細胞造成一定損害，但不會造成不可逆轉損傷。因此，為確定 TBHP 對 HepG2 細胞的最佳誘導條件，本實驗采用不同濃度的 TBHP 處理 HepG2細胞 ^2h ，采用 CCK-8 法測定細胞存活率。如圖 4所示，TBHP處理可以明顯降低HepG2細胞的存活率，并呈現出劑量依賴性。低濃度 TBHP 對 HepG2 細胞損傷較輕，當 TBHP 濃度為 400μmol?L^-1 時，細胞存活率降至 57% ，符合損傷模型的預期范圍。因此，選用 400μmol?L^-1 的 TBHP 干預 ^2h 作為造模條件用于后續研究。

2.5 SF- 天然低共熔溶劑對 TBHP 誘導 HepG2 細胞GSH 含量的影響

GSH 是細胞內重要的內源性非酶促抗氧化劑，具有清除自由基和過氧化物的功能，并有助于維持細胞內氧化還原平衡。GSH 缺乏通常與細胞抗氧化功能下降有關。此外，TBHP 誘導培養細胞毒性的主要機制是降低 GSH 水平 [17]。因此，維持細胞內高水平 GSH，對于抗 TBHP 誘導的毒性具有重要意義。如圖 5 所示，與模型組相比，SF 組、CiFe-SF 組、CiMe-SF 組、CiFe 組、CiMe 組的 GSH 含量顯著提高；CiFe-SF 組、CiMe-SF 組的 GSH 含量顯著高于SF 組，這說明經 TBHP 誘導后，SF 聯合天然低共熔溶劑使用比單獨使用對 HepG2 細胞氧化損傷的保護作用更好。

圖4 不同濃度的TBHP 對HepG2 細胞存活率的影響

圖5 SF- 天然低共熔溶劑對HepG2 細胞內GSH 含量的影響

2.6 SF- 天然低共熔溶劑對 TBHP 誘導 HepG2 細胞抗氧化酶活力的影響

體內抗氧化物酶活性是在機體氧化應激條件下維持細胞動態平衡的重要指標。SOD 和 CAT 是清除自由基的第一道防線，SOD 能把超氧陰離子自由基轉化為過氧化氫和水，使細胞不受自由基的損傷；CAT 能將過多的過氧化氫分解為水和氧氣，從而保持細胞的氧化還原平衡[18]。如圖6 所示，TBHP 處理后顯著降低了HepG2 細胞的SOD 活力，采用SF 和CiFe、CiMe 預處理顯著保護了 TBHP 誘導的 HepG2細胞氧化酶活力；CiFe-SF 組和 CiMe-SF 組的 SOD、CAT 活性優于 SF 組，說明 SF 與 CiFe、CiMe 聯合作用可以提高HepG2 細胞的抗氧化酶活性。

圖6 SF- 天然低共熔溶劑對HepG2 細胞抗氧化酶活力的影響

3 結論

綜上所述，SF 和天然低共熔溶劑（CiFe 和CiMe）協同具有更好的體外自由基清除能力和細胞層面增加 GSH 含量和恢復抗氧化酶系活力的能力，可作為一種潛在的抗氧化劑候選組合，本研究可為未來功能性產品的開發奠定理論基礎。然而，本研究仍有不足之處：僅局限于體外單一細胞體系，所選用的天然低共熔溶劑體系較為單一。在后續的研究中可選擇多種類型的天然低共熔溶劑；可在分子水平上進一步闡釋 SF 與天然低共熔溶劑協同抗氧化作用的分子機制。

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