超高效液相色譜法測量大豆中大豆異黃酮含量

摘 要：目的：建立超高效液相色譜法測定大豆中大豆異黃酮（包括大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素）含量的分析方法。方法：樣品經 80% 甲醇溶液超聲提取，離心后去除沉淀，經濾膜過濾后采用超高效液相色譜進行定量分析。結果：大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素在 1.0～10.0μg?mL^-1 線性關系良好，相關系數 r² 均 gt;0.999 ，檢出限和定量限分別為 0.5μg?mL^-1 、 1.5μg?mL^-1 ；儀器精密度和樣品穩定性良好；平均回收率為 95.96%～ 98.20% ，相對標準偏差為 0.90%～ 1.64% 。樣品大豆苷含量最高（ 358.5μg?g^-1） ）、大豆素含量最低 （21.2μg?g^-1 ）。結論：超高效液相色譜法操作簡單、靈敏度高、回收率高，且檢測速度快，可用于大豆中大豆異黃酮的測定。

Abstract： Objective： To establish an analytical method for the determination of soy isof lavones （including daidzein， daidzin， genistin and genistein） in soybean by ultra-high performance liquid chromatography （UHPLC）. Method： The samples were extracted with 80% methanol solution by ultrasonic wave， centrifuged to remove the precipitate， and filtered through a filter membrane for quantitative analysis by UHPLC. Result： The linear relationship between daidzein， daidzin， genistin and genistein was good in the range of 1.0～10.0μg?mL^-1 ， and the correlation coefficients r² were all greater than 0.999. The limits of detection and quantification were 0.5μgmL^-1 and 1.5μgmL^-1 ， respectively. The instrument precision and sample stability were good. The average recovery was 95.96%～98.20% ， and the relative standard deviation was 0.90%～1.64% . The content of daidzein was the highest （358.5μg?g^-1） and the content of daidzin was the lowest （21.2μg?g^-1） . Conclusion： UHPLC is simple to operate， highly sensitive， has high recovery rate， and is rapid in detection， and can be used for the determination of soybean isoflavones in soybean.

Keywords： ultra-high performance liquid chromatography; soybeans; soybean isoflavone

大豆異黃酮主要存在于大豆籽實中，屬于黃酮類化合物，由大豆生長過程中次生代謝產生[1]。大豆異黃酮是植物中的雌激素，能夠降低線粒體氧化應激和 DNA 損傷，改善機體分泌和代謝紊亂等問題，緩解體內炎性反應 [2-4]。大豆異黃酮主要以游離形式存在，包含大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素4 種成分 [5]。液相色譜、氣相色譜、紫外吸收法是檢測大豆異黃酮含量的常用方法[6]。普通的液相色譜法難以檢測結構相似的多組分化合物。氣相色譜需對異黃酮進行衍生，處理較為復雜，檢測成本較高。紫外吸收法靈敏度不高，僅適用于大豆異黃酮總含量測定，大豆提取液中脂肪、蛋白等雜質容易干擾目標組分檢測結果的準確性。基于此，本研究建立了一種超高效液相色譜法，以檢測大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素4 種大豆異黃酮含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

某品牌大豆，購自轄區超市，粉碎備用；大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素（純度 ?98% ），四川省維克奇生物科技有限公司；超純水；乙酸（分析純），Merck 公司；甲醇、乙腈（色譜純），Merck 公司。

1.2 儀器與設備

BO-E 渦旋混勻器，上海鉑溫儀器有限公司；LC-30AD 超高效液相色譜儀，日本島津公司；JP2204分析天平，天津市德安特傳感技術有限公司；VGT-2120QTD 超聲波儀，鄭州宇祥儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取 1.0g 大豆粉末于 50mL 離心管中，加入 20mL 甲醇溶液（ 80% ， u/ν ），渦旋混勻 60s 后置于超聲波儀 60^°C 提取 30min ， 15000r?min^-1 離心10min ，上清液經 0.45μm 濾膜過濾，轉移至 50mL 容量瓶；重復提取 1 次，合并 2 次提取液，加入甲醇溶液（ 80% ）定容，混勻。

1.3.2 標準溶液制備

分別稱取適量大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素，置于 100mL 容量瓶，用甲醇溶液（ 80% ）溶解，稀釋并定容，獲得濃度為 0.1mg?mL^-1 的混合標準儲備液。使用甲醇溶液將大豆異黃酮混合標準儲備液稀釋成濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、 8.0μg?mL^-1 和 10.0μg?mL^-1 的標準系列溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Xbridge BEH C₁₈ 柱（ 100mm^×2.1mm ，1.7um ）；進樣量為 5μL ；流速為 0.5mL?min^-1 ；測定波長為 260nm ；大豆異黃酮分離度和保留值易受溫度影響，為縮短保留時間，柱溫選擇 30°C ；流動相為乙腈（A） -0.2% 乙酸（B）。梯度洗脫程序： 0～ 5min ， 85%B ； 5～ 10min ， 85%65%B ； 10～ 15min ， 65%B ； 15～20min ， 65%85%B 。

2 結果與分析

2.1 線性關系、檢出限、定量限

以濃度、相應峰面積分別為橫坐標、縱坐標，繪制大豆異黃酮成分標準曲線；分別以3 倍信噪比、10倍信噪比作為檢出限、定量限，結果見表1。大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素在 1.0～10.0μg?mL^-1 線性關系良好，相關系數 r² 均 gt;0.999 ，檢出限均為0.5μg?mL^-1 ，定量限均為 1.5μg?mL^-1 。

2.2 精密度試驗

重復進樣 5 次同一標準工作液，檢測大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素的峰面積，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）分別為 0.25% 、0.20% 、 0.26% 、 0.22% ，見表2。

2.3 穩定性試驗

加入標準工作液至樣品溶液，重復進樣5 次（每次間隔 ^4h ），測定大豆異黃酮不同成分峰面積，RSD 在 0.19%～ 0.23% ，表明標準工作液在 24h 內較為穩定，見表3。

2.4 回收率試驗

對樣品進行不同水平的加標，檢測并計算大豆異黃酮不同成分的回收率。如表 4 所示，大豆異黃酮平均回收率為 95.96%～ 98.20% ，RSD 為0.90%～ 1.64% 。

2.5 大豆樣品檢測

吸取 5μL 樣品溶液進樣，檢測大豆異黃酮不同成分含量。如表5 所示，大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素含量分別為 358.5、21.2、88.7、26.2 μg·g-1。

表1 大豆異黃酮線性方程、檢出限及定量限

表3 大豆異黃酮穩定性

表5 大豆異黃酮成分含量 單位： μg?g^-1

3 結論

大豆異黃酮具有抗氧化、抗癌、抗炎等多方面生物功效，在我國食品、保健品等行業應用廣泛[7]。本研究建立了超高效液相色譜法測定大豆中大豆異黃酮含量的方法，能夠在較大的樣品流量下，實現快速分離。該方法在 1.0～10μg?mL^-1 線性關系良好，不同大豆異黃酮成分檢出限均為 0.5μg?mL^-1 ，定量限均為 1.5μg?mL^-1 。精密度、穩定性試驗的RSD 分別為 0.20%～ 0.26% 、 0.19%～ 0.23% ；加標回收試驗平均回收率為 95.96%～ 98.20% ，RSD 為0.90%～ 1.64% ，表明該方法的靈敏度、穩定性良好，準確度高。大豆中大豆苷含量最高（ 358.5μg?g^-1 ），大豆素含量最低（ 21.2μg?g^-1 ）。

參考文獻

[1] 顧文， 黎晨曼， 孫震， 等. 堿- 酶水解結合分散式固相萃取提高大豆異黃酮活性總量測定的準確性[J]. 分析測試學報 ，2025，44（1）：106-115.

[2] 李麗， 汪夢哲， 劉賽賽， 等. 大豆異黃酮通過抑制Wnt/Ca²⁺ 信號通路減輕大鼠腦缺血再灌注引起的鈣超載[J].南方醫科大學學報 ，2024，44（6）：1048-1058.

[3]WANG Y M，GUO J P，YU F，et al.The association between soy-based food and soy isoflavone intake and the risk of gastric cancer： a systematic review and meta-analysis[J].J Sci Food Agric，2021，101（13）：5314-5324.

[4] 孟新靜 ， 楊旭 ， 孟德尚 ， 等 . 大豆次生代謝產物結構、生物活性及其作用機制研究進展 [J]. 食品科學 ，2024，45（20）：35-47.

[5] 吳俊發， 譚健輝， 馬鑫. 超高效液相色譜法同時測定保健品中4 種大豆異黃酮[J]. 食品安全質量檢測學報 ，2021，12（6）：2264-2269.

[6] 何繼紅， 郝霖雨， 朱高群. 大豆異黃酮檢測方法研究進展 [J]. 養殖與飼料 ，2023，22（6）：113-115.

[7]QIAO Y L，ZHANG K N，ZHANG Z C，et al.Fermented soybean foods： a review of their functional components， mechanism of action and factors inf luencing their health benefits[J].Food Res Int，2022，158：111575.