效液相色譜法測定皺皮木瓜成熟果實(shí)中維生素C

Abstract： A high performance liquid chromatography method was established to determine vitamin C of Chaenomeles speciosa. stationary phase was Inertsil NH₂ C₁₈ 250mm×4.6mm ， 5μm ）. The mobile phase was acetonitril- 0.1% oxalic acid solution （85：15） . The flow rate was 1.0mL?min^-1 ， the column temperature was 30°C ， and the detection wavelength was 424nm . Taking Chaenomeles speciosa speciosa as the determination object， oxalic acid solution as the extraction solvent， the mass concentration and ultrasonic time were investigated. The results showed that the extraction efficiency was the highest when 0.5% oxalic acid solution was used as the extraction solvent and ultrasonic time was 20min . The vitamin C showed a good linear relationship with the range between 4.27μg?mL^-1 to 21.36μg?mL^-1 ， the correlation coefficient was 0.999 6. The recoveries were 97.80% to 99.04% ， the relative standard deviation were 0.50% to 0.83% . This method is simple and accuracy is high， it can be used for quality control and evaluation of mature fruit in Chaenomeles speciosa.

Keywords： high performance liquid chromatography; Chaenomeles speciosa; vitamin C

木瓜為木瓜屬植物的果實(shí)，有“百益之果”之稱，為原衛(wèi)生部2003 年首批認(rèn)定的藥食兼用的食品之一。《本草綱目》記載：“木瓜性脆，可蜜漬為果，去子蒸爛，搗爛入蜜與姜作煎，冬日飲尤付佳。”《齊民藥術(shù)》記載：“木瓜以苦酒鼓汁，可案酒食，密封藏百日，乃食之甚益人。”《王禎農(nóng)書》記載[1]：“此物入肝，益筋與血，入藥有決功，以蜜漬，食甚益人。”此外，《食療本草》《千金方》《名醫(yī)》等古醫(yī)書都有對木瓜食療作用的精辟論述。經(jīng)常食用木瓜能舒筋活絡(luò)、和胃化濕，還具有抗氧化、抗癌防癌等功效[2-3]。

木瓜富含有機(jī)酸、氨基酸、果膠、維生素和微量元素等，具有很高的食用保健價(jià)值，不僅被應(yīng)用于美容化妝品和保健品領(lǐng)域，且在食品工業(yè)中，已有大量木瓜產(chǎn)品上市，如木瓜飲料、木瓜醋、木瓜酒和木瓜果脯等 [4]，深受人們的喜愛。目前，木瓜的研究主要集中在熊果酸、齊墩果酸、綠原酸和蘋果酸等有機(jī)酸，多糖、總黃酮、氨基酸等成分的測定 [5-12]。木瓜為藥食同源物種，近成熟果實(shí)表面呈綠黃色，具有較高的藥用價(jià)值，果實(shí)成熟后表面呈黃色，具有較高的食用價(jià)值，現(xiàn)多以近成熟果實(shí)為研究對象來研究木瓜的藥用價(jià)值。木瓜中含有豐富的維生素類營養(yǎng)成分，維生素C是一種人體必需的營養(yǎng)成分之一，對人體具有重要的生理功能。維生素 C 含量測定方法有滴定法、比色法、紫外分光光度法、高效液相色 譜 法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）等 [13]，HPLC 法具有準(zhǔn)確度、精密度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用范圍較廣。張秀真等 [14] 采用HPLC 法測定了宣木瓜中水溶性維生素含量，樣品用0.1mol?L^-1 鹽酸提取后再減壓濃縮，操作較煩瑣；流動(dòng)相為乙酸鈉 - 乙酸緩沖液體（pH 值為 5.8），配制較復(fù)雜，且維生素 C 的色譜峰分離度低。本文以皺皮木瓜為研究對象，通過優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件和色譜條件，建立 HPLC 法測定皺皮木瓜中維生素 C 含量，該方法操作簡單、流動(dòng)相配制簡單、分離度好，適用性廣，可用于測定不同木瓜成熟果實(shí)中維生素C含量，為木瓜食用品種的優(yōu)選及資源進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

皺皮木瓜的成熟果實(shí)，共 10 批次，采自山東亞特藥用植物生態(tài)園，采摘后的果實(shí)，分別進(jìn)行標(biāo)記，取出種子，用不銹鋼刀將果肉切成 1～2cm 厚的薄片，放于瓷盤中，在 60°C 鼓風(fēng)干燥箱中干燥 ^48h 后，粉碎，過 3 號篩，得到皺皮木瓜粉末，備用。

1.1.2 試劑與儀器

維 生 素 C 對 照 品（ 100.0% ， 批 號：100425-202105），中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純），安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆徊菟帷⒘姿岫溻洝⒘姿岷蛠喠蛩釟溻c（均為分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。LC-20 AT 高效液相色譜儀，配有PDA檢測器，日本島津儀器有限公司；色譜柱（Inertsil NH₂C₁₈ ），技爾（上海）商貿(mào)有限公司；KQ-600GDV 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FW100 高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀有限公司；MS204TS 電子天平（感量為 0.01mg ），瑞士梅特勒 - 托利多儀器公司；GZX-9076 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液

精密稱取維生素 C 對照品 10.68mg ，置于50mL 容量瓶中，加入 0.5% 草酸溶液溶解并稀釋定容至刻度線，搖勻，得到質(zhì)量濃度為 213.6μg?mL^-1 對照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取對照品儲(chǔ)備溶液 5mL ，置于 50mL 容量瓶中，用 0.5% 草酸溶液稀釋至刻度線，搖勻，得到質(zhì)量濃度為 21.36μgmL^-1 對照品溶液。

1.2.2 樣品溶液

取皺皮木瓜粉末約 0.25g ，精密稱定，置于50mL 棕色容量瓶中，加入 0.5% 草酸溶液 40mL ，超聲處理 20min （功率 500W ，頻率 40kHz ），冷卻至室溫，用 0.5% 草酸溶液稀釋至刻度線，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得待測樣品液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

分別取對照品溶液和樣品溶液，使用高效液相色譜儀進(jìn)樣測定，記錄色譜峰面積，以維生素 C 質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中維生素 C的含量。

1.4 色譜條件

色譜柱：Inertsil NH₂C₁₈ 柱（ 250mm^×4.6mm ，5μm ）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1% 草酸溶液（體積比為85：15 ）；檢測波長： 240nm ；流量： 1.0mL?min^-1 ；柱溫： 30^°C ；進(jìn)樣量： 10μL 。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

2.1.1 草酸溶液濃度和超聲時(shí)間的選擇

（1）不同濃度草酸溶液對皺皮木瓜維生素 C 提取效果的影響。維生素 C 在空氣中極易被氧化，在酸性介質(zhì)中，其氧化的速度稍慢，較為穩(wěn)定。以皺皮木瓜為研究對象，參考扶慶權(quán) [15] 的測定方法，選用質(zhì)量濃度分別為 0.1% 、 0.5% 和 1.0% 的草酸溶液為提取溶劑，考察草酸對皺皮木瓜成熟果實(shí)中維生素 C 的提取效果。由表 1 可知， 0.5% 草酸溶液作為提取溶劑時(shí)，維生素 C 含量最高，故選擇 0.5% 草酸溶液為提取溶劑。

（2）不同超聲時(shí)間對皺皮木瓜維生素 C 提取效果的影響。以 0.5% 草酸溶液作為溶劑，考察皺皮木瓜中維生素 C 在不同超聲時(shí)間（15、20、 30min ）的提取效果。由表 2 可知，當(dāng)超聲時(shí)間為 20min 時(shí)，維生素C 含量最高，故選擇超聲（功率： 500W ，頻率：40kHz ）時(shí)間為 20min 。

表1 不同濃度草酸溶液對皺皮木瓜維生素C 提取效果的

2.1.2 檢測波長的選擇

采用PDA 檢測器，在 200～400nm 掃描對照品溶液，采集光譜圖。由圖1 可知，維生素C 在 242nm 處有最大吸收，因此選擇檢測波長為 242nm 。

圖1 對照品光譜圖

2.1.3 色譜柱選擇

分別選用 Inertsil NH₂C₁₈ 柱（ 250mm^×4.6mm ，5μm ）、Kromasil C₁₈ 柱（ 250mm×4.6mm ， 5μm ）進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)使用 Inertsil NH₂C₁₈ 柱時(shí)，基線平穩(wěn)，分離度較好，色譜峰形對稱，因此選擇Inertsil NH₂ C₁₈ （ 250mm×4.6mm ， 5μm ）柱作為分析柱。

2.1.4 流動(dòng)相選擇

本文考察乙腈 -0.01mol?L^-1 磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 2.4）、乙腈 -0.1% 草酸溶液 ^[15]2 種流動(dòng)相體系，采用等度洗脫的方式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈 -0.01mol?L^-1 磷酸二氫鉀作為流動(dòng)相時(shí)，維生素 C 色譜峰形對稱性較差，基線不平穩(wěn)，而采用乙腈 -0.1% 草酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，維生素 C色譜峰的分離效果、峰形對稱性均較好，基線平穩(wěn)且保留時(shí)間合適，故選擇乙腈 -0.1% 草酸溶液作為流動(dòng)相。

2.1.5 柱溫選擇

本文考察不同柱溫（ （25，30，35°C ）對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明，隨著柱溫的升高，維生素 C 色譜峰的保留時(shí)間逐漸縮短，峰形、分離度無明顯變化，3 種溫度均能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求。綜合考慮色譜峰分離效果、柱溫箱控溫效果等因素，選擇柱溫為 30^°C 。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取對照品溶液、樣品溶液分別按1.4 色譜條件下進(jìn)樣測定，色譜圖如圖 2 所示。可以看出，在樣品溶液和對照品溶液的色譜圖中維生素 C 色譜峰的保留時(shí)間一致，理論板數(shù)大于5 000，分離度大于1.5，表明系統(tǒng)適用性良好。

2.3 方法建立

2.3.1 線性關(guān)系與定量限

用自動(dòng)進(jìn)樣器精密吸取對照品溶液，在 1.4 色譜條件下進(jìn)行測定，以對照品質(zhì)量濃度 （x） 為橫坐標(biāo)，色譜峰面積 （y） 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)濃度為 4.27～21.36μg?mL^-1 時(shí)，線性方程為 y= 301 801x-11 289 （ r=0.999 6 ），說明線性關(guān)系良好。將對照品溶液用甲醇逐級稀釋，以 3 倍信噪比（ （S/N） 對應(yīng)的質(zhì)量濃度為方法檢出限，為 0.09μg?mL^-1 ；以 10 倍信噪比（ χ_S/N） 對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限，為0.31μg?mL^-1 。

圖2 對照品溶液、樣品溶液色譜圖

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一皺皮木瓜樣品溶液，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0、 4.0h 和 5.0h ，在1.4 色譜條件下進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果見表3。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandard Deviation，RSD）為 1.05% ，說明樣品溶液在 5h 內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.3 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

取已測含量的皺皮木瓜粉末，分別精密加入維生素 C 對照品儲(chǔ)備液 1.5， 2.0， 2.5mL ，每個(gè)濃度平行處理 3 份，按 1.2.2 方法制成加標(biāo)樣品溶液。在 1.4 色譜條件下分別進(jìn)樣測定，計(jì)算加標(biāo)回收率和 RSD，結(jié)果見表 4。樣品的平均回收率為97.80%～ 99.04% ，RSD 為 0.50%～ 0.83% ，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表4 加標(biāo)回收與精密度結(jié)果

3 結(jié)論

本研究以皺皮木瓜為研究對象，建立 HPLC 法測定其維生素 C 含量的方法。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的 RSD為 1.05% ，說明樣品溶液具有較好的穩(wěn)定性。樣品的加標(biāo)平均回收率為 97.80%～ 99.04% ，RSD 為0.50%～0.83% ，說明該方法的準(zhǔn)確度高、精密度良好。本文建立的方法適用于皺皮木瓜的質(zhì)量評價(jià)和控制，為木瓜食用資源的開發(fā)、利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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