基于液相色譜-串聯質譜法的農產品中氟苯尼考胺的檢測方法優化

Abstract： Objective： To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of f lorfenicol amine in agricultural products， and to optimize the method. Method： 0.05% ammonia aqueous solution was used instead of traditional ammonium formate solution as the aqueous phase in the mobile phase， and the samples were extracted by 2% ammoniated ethyl acetate， defatted by n-hexane， ammoniated ethyl acetate reverse extraction， and determined by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Result： The linear relationship of the f lorfenicol amine was good at 1～50ng?mL^-1 R²gt;0.999 ）， the recovery rate was 94.3%～ 112.7% ， and the relative standard deviation （RSD） was 1.9%～ 6.6% . Conclusion： This method can effectively solve the problems of abnormal peak emergence and matrix interference of f lorfenicol amine with high accuracy， and is suitable for the daily detection of f lorfenicol amine in agricultural products.

Keywords： f lorfenicol amine; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; optimization of mobile phase

氟苯尼考胺（Florfenicol Amine，FFA）是氟苯尼考在動物體內的代謝產物，因與母體藥物共同構成獸藥殘留風險，被列為聯合檢測指標 [1]。在實際工作中，氟苯尼考胺的檢測面臨諸多挑戰。若無法準確檢出氟苯尼考胺的殘留量，則會導致農產品中氟苯尼考獸藥殘留量的檢測結果出現偏差，對消費者健康造成潛在風險。因此，優化氟苯尼考胺的檢測方法至關重要。

液相色譜 - 串聯質譜法（Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，LC-MS/MS）是 一 種 將液相色譜的高效分離能力與質譜的高靈敏度、強定性能力相結合的現代分析技術，在獸藥殘留檢測領域發揮著重要的作用[2]。流動相在液相色譜分析中尤為重要，流動相種類不同、比例不同將直接影響出峰情況[3]。傳統的流動相體系無法實現氟苯尼考胺與其他共存雜質的有效分離，進一步影響了檢測結果的準確性。由于氟苯尼考胺含 NH₂ 官能團，極性強，出峰過早，容易出現拖尾、分叉等現象，在基質干擾的情況下，這種現象更加嚴重。

本研究選擇氨水作為堿性添加劑來抑制非目標組分的吸附。《食品安全國家標準 動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定 液相色譜 - 串聯質譜法》（GB 31658.20—2022）[4] 可同時檢測氟苯尼考胺、氯霉素、氟苯尼考、甲砜霉素 [5]，而氨水濃度過高會抑制共檢其他3 種負離子組分的響應值，因此本研究經過幾次預實驗后，以流動相水相 0.05% 氨水為實驗組，以傳統流動相水相 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液為對照組，并對豬肉基質和雞肉基質添加3 個濃度的加標回收，對比分析實驗組和對照組的色譜圖。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉和雞肉，均購自當地農貿市場和超市，經 檢測為陰性樣品，故作為本次實驗的基質。

氟 苯 尼 考 胺、 氟 苯 尼 考 胺 -D₃ 標 準 溶 液（ 100μg?mL^-1 ），壇墨質檢；甲醇、乙腈（色譜純），壇墨質檢；乙酸乙酯（色譜純），壇墨質檢；氨水（色譜純），西隴科學。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX 4500+ Triple Quad ? 質 譜 儀， 美 國SCIEX 公司；LC-20A 高效液相色譜儀，島津公司；高速離心機，湖南湘儀；萬分之一天平，德國Sartorius 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

分別取適量新鮮的豬肉、雞肉試樣，絞碎，并均質。取均質后試樣 2g ，置于離心管中，加內標工作液，渦旋混勻，再加 2% 氨化乙酸乙酯溶液10mL ，渦旋，離心。上清液轉入另一 50mL 離心管中，殘渣重復提取一次。合并兩次提取液，于 50^°C 氮氣吹干，取殘渣，加 4% 氯化鈉溶液 3mL ，渦旋使其溶解，再加 4% 氯化鈉飽和的正己烷 5mL ，渦旋，離心，棄去上層正己烷層，重復脫脂一次。加 2% 氨化乙酸乙酯溶液 5mL ，渦旋振蕩 5min ，離心，取上層有機相。重復萃取一次，合并有機相， 50^°C 氮氣吹干，加 20% 甲醇溶液 1.0mL ，渦旋 30s ，過 0.22μm 濾膜，供液相色譜質譜聯用儀測定，內標法定量[4]。

1.3.2 儀器條件

（1）高效液相色譜條件。色譜柱：Waters C₁₈ （ 3.0mm×150mm ， 2.7μm ）；流動相A 相：對照組為10mmol?L^-1 甲酸胺溶液，實驗組為 0.05% 氨水溶液；B 相：乙腈。梯度洗脫程序： 0～0.5min ， 98%A ；0.5～ 3.5min ， 98%40%A ； 3.5～ 4.0min ，40%98% ； 4.0～ 6.0min ， 98%A ； 流 速：0.6mL?min^-1 ；柱溫： 30^°C ；進樣量： 5μL 。

（2）質 譜 條 件。 離 子 源： 電 噴 霧 電 離 源（Electrospray Ionization，ESI）， 正 離 子 模 式； 霧化氣壓強： 50psi （約 344.7kPa ）；輔助加熱氣壓強：55 psi（約 344.7kPa ）；簾氣壓強： 30psi （約275.8kPa ）；碰撞氣壓強：9 psi（約 62.1kPa ）；離子噴霧電壓： 5500V ；離子源溫度： 500^qC ；監測模 式： 多 反 應 監 測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）[4]。氟苯尼考胺和氟苯尼考胺 -D₃ 質譜參數見表1。

1.3.3 標準溶液配制

參照 GB 31658.20—2022，用 20% 甲醇溶液稀釋，配制成 1、2、5、10、20、 40ng?mL^-1 和 50ng?mL^-1 的氟苯尼考胺標準系列溶液；氟苯尼考胺 -D₃ 濃度為 ，臨用現配[4]。

2 結果與分析

2.1 流動相優化

（1）標準溶液。以傳統流動相水相 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液作為對照組，以流動相水相 0.05% 氨水作為實驗組，對標準溶液進行 FFA 色譜圖對比分析。對照組標準溶液 FFA 響應值和峰形情況如圖 1所示， 2ng?mL^-1 FFA 標準溶液無響應， 10ng?mL^-1 、

表1 氟苯尼考胺和氟苯尼考胺 -D₃ 質譜參數

注： * 表示定量離子。

40ng?mL^-1 標準溶液有響應，但峰形對稱性不佳，不利于定性定量分析。實驗組標準溶液 FFA 響應值和峰形情況見圖2。可以看出，濃度為 2.10.40ngmL^-1 的 FFA 標準溶液均有響應，且與對照組相比，實驗組的保留時間推遲，峰形對稱尖銳。

（2）豬肉基質加標。以傳統流動相水相 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液為對照組，以流動相水相 0.05% 氨水作為實驗組，對豬肉基質加標進行 FFA 色譜圖對比分析。如圖 3 所示，以 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液為流動相水相時，不同濃度的豬肉基質加標均無明顯響應。以 0.05% 氨水溶液為流動相水相，豬肉基質 FFA 加標 2、10、 對應的響應值分別為 3.937×10³ 、1.977×10⁴ 、 6.257×10⁴ ，響應明顯，且峰形對稱尖銳（圖 4）。

（3）雞肉基質加標。以傳統流動相水相 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液為對照組，以流動相水相 0.05% 氨水為實驗組，對雞肉基質加標進行FFA 色譜圖對比分析。如圖 5 所示，以 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液為流動相水相，雞肉基質FFA 加標2、 均無明顯響應，40ng?mL^-1 的響應值為 2.022×10⁴ ，但峰形不好。由圖 6 可知，以 0.05% 氨水溶液為流動相水相，雞肉基質 FFA 加標 2、10、 40ng?mL^-1 響應強烈，峰形良好，未出現明顯的拖尾或前沿現象。

2.2 線性關系與檢出限

取 1.3.3 項配制的標準工作溶液，以定量離子峰面積比為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，氟苯尼考胺在 1～50.0ng?mL^-1 線性關系良好，相關系數 R²=0.99983 ，回歸方程為 y= 1.32491x+0.02193 。根據3 倍信噪比確定方法檢出限，10 倍信噪比確定定量限，得到的檢出限為 0.2μg?kg^-1 ，定量限為 0.7μg?kg^-1 ，均滿足 GB 31658.20—2022 要求，表明該方法具有較高的靈敏度，能夠滿足痕量分析的要求。

2.3 回收率與精密度

分別在豬肉基質和雞肉基質樣品中添加低（ 2ng?mL^-1 ）、 中（ 10ng?mL^-1 ）、 高（ Φ_40ng?mL^-1 ）3 個水平的 FFA 標準溶液，按照優化后的流動相及相關儀器條件進行加標回收實驗，每個水平平行測定 6 次。由表 2 可知，氟苯尼考胺平均回收率為94.3%～ 112.7% ，相對標準偏差（Relative StandardDeviation，RSD）在 1.9%～ 6.6% ，表明該方法具有良好的準確性和精密度。

圖3 豬肉基質對照組色譜圖

圖6 雞肉基質實驗組色譜圖

表2 氟苯尼考胺加標回收率與精密度（ （n=6） ）

3 結論與討論

通過對實驗組和對照組的氟苯尼考胺響應值分析，發現傳統以 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液作為流動相水相時，響應不明顯，靈敏度不高，峰形不好，特別是基質作用下該情況更為嚴重，已無法滿足檢測要求。以 0.05% 氨水溶液作為流動相水相，可明顯抑制氟苯尼考胺NH?官能團對非目標化合物的吸附，延長保留時間，增強靈敏度，改善峰形，提升氟苯尼考胺檢測的準確性與可靠性。

在實際樣品檢測驗證中，選取豬肉和雞肉作為代表性基質，評估優化后流動相體系的適用性。向兩類樣品中分別添加 40ng?mL^-1 的氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素標準溶液，采用優化后的 0.05% 氨水溶液作為流動相水相進行檢測。結果顯示，豬肉樣品中3 種獸藥的響應值分別為 9.796×10⁴ 、 6.062×10⁴ 、5.017×10⁴ ，雞肉樣品呈現相似的響應特征。將該結果與前期采用 10mmol?L^-1 甲酸胺溶液作為流動相水相的檢測數據進行對比，發現優化后的流動相體系雖使響應值輕微降低，但仍能滿足目標獸藥的檢測需求，證實了該流動相體系在實際樣品檢測中的可行性。

綜上，本研究可為農產品中氟苯尼考胺殘留量檢測提供有效的方法，對于保障食品安全具有重要意義。

參考文獻

[1] 趙津子 . 氟苯尼考胺 IgY 抗體的制備及 ELISA 檢測方法的建立[D]. 楊凌： 西北農林科技大學，2012.

[2] 呂晶. 液相色譜- 質譜聯用技術結合新型捕獲分子用于多種葡萄球菌腸毒素的檢測分析[D]. 北京： 軍事科學院 ，2024.

[3] 劉帆， 陳翼琳， 黃清菁， 等. 優化嬰幼兒輔食米粉中無機砷檢測方法的研究[J]. 輕工標準與質量，2024（6）：83-84.

[4] 農業農村部， 國家市場監督管理總局， 國家衛生健康委員會. 食品安全國家標準 動物性食品中酰胺醇類藥物及其代謝物殘留量的測定 液相色譜- 串聯質譜法：GB 31658.20—2022[S]. 北京 ： 中國標準出版社 ，2022.

[5] 劉凱. 動物可食性組織中甲砜霉素、氟苯尼考胺及氟苯尼考殘留的測定 [J]. 品牌與標準化 ，2024（3）：4-11.