超高效液相色譜-串聯質譜法測定蜂蜜中鏈霉素與雙氫鏈霉素殘留量

Abstract： Objective： To establish an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the determination of residual levels of streptomycin （SM） and dihydrostreptomycin （DHSM） in honey. Method： The sample was extracted with 2% trichloroacetic acid， 10mmol?L^-1 ammonium acetate， 0.4mmol^.L^-1 ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate， and 0.5% NaCl solution. It was purified using an Oasis HLB column and eluted with a 10% formic acid- 5% isopropanol aqueous solution. The membrane was filtered and analyzed using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Using SIELC Obelisk R chromatography column， gradient elution was performed with acetonitrile 0.5% formic acid solution （pH=2.5） ） as the mobile phase. Multiple reaction monitoring mode was used for determination， and external standard method was used for quantification. Result： SM and DHSM showed a good linear relationship between ， with a detection limit of 2μg?kg^-1 and a quantification limit of 5μg?kg^-1 ; the average recovery rate （n=6） is 90.0% to 97.5% ， and the relative standard deviation （n=6） is 0.4% to 4.2% . Conclusion： This method meets the detection requirements of streptomycin and dihydrostreptomycin， with high sensitivity and simple operation， and is suitable for the detection of streptomycin and dihydrostreptomycin in large quantities of honey samples.

Keywords： ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; streptomycin; dihydrostreptomycin

氨基糖苷類抗生素是一類由糖苷鍵連接氨基糖基團與氨基環多醇構成的藥物，也是繼青霉素之后被發現的重要抗生素，根據其發展歷史可知，首個氨基糖苷類抗生素鏈霉素（Streptomycin，SM）于 1940年被發現 [1]。鏈霉素需在干燥環境中保存，一旦吸潮便易分解變質，其在 pH 值為 5.0～7.5 時較為穩定，而在過酸或過堿條件下會水解為鏈霉胍和鏈霉雙糖 [2]。在蜜蜂污仔病的防治中，鏈霉素是一種常用藥物。然而，長期使用鏈霉素可能導致其在動物體內蓄積，進而對人類健康構成潛在威脅 [3]。鏈霉素進入生物體后以原藥形式存在，無法代謝降解，其排泄僅依賴腎臟途徑。盡管如此，仍有一小部分鏈霉素會在腎小管的上皮細胞中富集，從而引發腎毒性，并可能伴隨耳毒性，損害前庭神經功能[4]。雙氫鏈霉素是通過將鏈霉素分子中的鏈霉糖醛基還原成伯醇基而生成的一種衍生物，其抗菌效能與鏈霉素相近，但對前庭神經的毒性更強[3]。

目 前， 針 對 鏈 霉 素 和 雙 氫 鏈 霉 素（Dihydrostreptomycin，DHSM） 的 檢 測 方 法 主 要有微生物法、生物免疫法、液相色譜法以及高效液 相 色 譜 串 聯 質 譜 法（High-Performance LiquidChromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）。其中，HPLC-MS/MS 因其無須衍生，操作簡便快速且靈敏度顯著高于其他方法而被廣泛應用。劉曉茂等 [5-6] 采用 HPLC-MS/MS 對蜂蜜中的鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留進行檢測，其檢測限分別為2ng?g^-1 和 1ng?g^-1 。 此 外， 周 玲 [7] 建 立 了 基 于HPLC-MS/MS 的蜂巢及蜂產品中林可霉素殘留檢測方法，檢測出林可霉素殘留量在 0.5～20.0μg?kg^-1， 。

本文以蜂蜜為研究基質，通過優化基質樣品前處理條件、色譜柱類型及流動相組成等因素，建立了測定蜂蜜中鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留量的超高效液相色譜 - 串聯質譜法（Ultra-High PerformanceLiquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）。該方法為食品安全監管中的蜂產品檢測提供了可靠的理論依據和技術支持，尤其在氨基糖苷類藥物殘留分析領域具有重要應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜，購自內蒙古呼和浩特市。鏈霉素標準品（純度 89.8% ）、雙氫鏈霉素標準品（純度 95.1% ），Dr.Ehrenstorfer 公司；甲酸、乙腈，均為色譜純；乙醇、異丙醇、乙酸銨、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物、氯化鈉、三氯乙酸（TrichloroaceticAcid，TCA）和氫氧化鉀，均為分析純。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX Triple Quad TM 6500 超高效液相色譜串聯質譜；氮吹儀；渦旋儀；電子天平；Oasis HLBSPE 小柱（6cc Vac 小柱、 500mg 吸附劑、 60μm ）。

1.3 試驗方法

1.3.1 混合標準溶液配制

分別稱取適量（精確至 0.01mg ）鏈霉素與雙氫鏈霉素標準品置于容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制為鏈霉素與雙氫鏈霉素濃度均為 100μgmL^-1 的標準儲備液。取上述鏈霉素、雙氫鏈霉素標準儲備液各 0.1mL 置于 10mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度線，配制得到濃度為 1μg?mL^-1 的混合標準中間液，備用。

準確量取上述混合標準中間液 0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、 1.000mL 置于 10mL 棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度線，配制鏈霉素與雙氫鏈霉素系列混合標準工作溶液濃度為 2.5、5.0、10.0、25.0、 50.0ng?mL^-1 和 100.0ng?mL^-1 。

1.3.2 提取及洗脫溶液配制

（1）提取液。稱取 0.385g 乙酸銨置于 500mL 容量瓶中，加入去離子水約 450mL ，溶解后用甲酸調節 pH 值至 4.0，向容量瓶中加入 0.074g 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物、 2.5g 氯化鈉、 10g TCA。充分混合溶解，去離子水定容至刻度線。

（2）洗脫液。配制 10% 甲酸 -5% 異丙醇水溶液。

（3）堿性溶液。分別配制 10% 和 50% 氫氧化鉀水溶液。

1.3.3 樣品前處理

稱取 3g （精確至 0.01g ）蜂蜜樣品，置于 50mL 離心管中，加入 20mL 提取液，渦旋 2min 混勻，在4^°C 冰箱中靜置 30min 。隨后將樣品再次渦旋混勻，并在 4°C 下以 3200r?min^-1 離心 10min 。使用塑料移液管定量移取上清液至另一個 50mL 離心管中。在固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）和凈化前，采用經校準的 pH 計，將上清液用堿性溶液（ 50% 和10% 氫氧化鉀溶液）調節 pH 值為 6.75±0.25 ，備用。

將 SPE 小柱用 3mL 甲醇和 3mL 去離子水活化和平衡后，進行上樣操作。之后，用 3mL 去離子水沖洗小柱，并在真空下干燥 15min 。采用 3mL 洗脫溶液洗脫分析物，過濾膜后直接用于儀器測定。

1.3.4 儀器分析條件

（1）色譜條件。色譜柱：SIELC Obelisc R 陽離子交換色譜柱（ 150mm^×2.1mm ， 5μm ）；柱溫：40°C ；進樣量： 30μL ；流動相：乙腈 -0.5% 甲酸溶液（ pH=2.5 ）。

（2）質譜條件。離子源：電噴霧正離子源；電噴霧電壓： 4500V ；檢測方式：多反應監測；離子源溫度： 550°C ；氣簾氣壓強： 20psi 。鏈霉素和雙氫鏈霉素質譜參數見表 1。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

樣品的前處理主要涉及目標檢測物的提取、凈化及濃縮等步驟，通過優化前處理條件，可提高目標檢測物從基質中的提取率，同時有效去除雜質干擾，從而達到降低檢出限的目的 [8-11]。

2.1.1 提取液選擇與優化

SM、DHSM 的提取液一般采取優化磷酸鹽緩沖液與TCA 濃度等方式，本試驗分別考察提取液A（ 2% TCA 的磷酸鹽緩沖溶液）、提取液 B（ 3% TCA、10mmol?L^-1 乙酸銨、 0.4mmol?L^-1 乙二胺四乙酸二鈉鹽水合物與 0.5%NaCl 溶液）、提取液 C（ 5% TCA-乙腈溶液）對鏈霉素和雙氫鏈霉素回收率的影響。如圖 1 所示，采用提取液 A 和提取液 C 時，SM 與DHSM 的回收率在 52.67%～ 62.00% ；采用提取液B 時，兩種化合物的回收率在 80.00%～ 85.00% 。因此，選取提取液B 進行后續試驗，并優化TCA 濃度。

考察不同TCA 濃度（ 1% 、 2% 、 3% 、 4% 和 5% ）對 SM 與 DHSM 回收率的影響。如圖 2 所示，隨著TCA 濃度的增加，SM 與 DHSM 回收率均呈現先上升后下降的趨勢，其中在TCA 濃度為 2% 時，SM 和DHSM 回收率達到最高，分別為 95.33% 和 96.00% 。因此，最終確定提取液為 2% TCA、 10mmol?L^-1 乙酸銨、 0.4mmol?L^-1 乙二胺四乙酸二鈉鹽水合物與0.5%NaCl 溶液。

圖1 不同提取液對SM 和DHSM 回收率的影響

圖 2 不同 TCA 濃度對 SM 和 DHSM 回收率的影響

2.1.2 固相萃取柱選擇

固相萃取是一種常用的樣品凈化技術。該方法通過將試樣溶液加載到 SPE 柱上，利用固體吸附劑對目標分析物進行選擇性吸附，從而實現目標物與樣品基質的有效分離。隨后，通過適當的洗脫液將目標物從吸附劑上洗脫下來，從而在保證目標物最小損失的同時實現高效凈化[8]。本試驗比較了 C₁₈ 柱、Oasis HLB 小柱、WCX 柱與 MCX 柱 4 種固相萃取柱對 SM 和 DHSM 回收率的影響。由圖 3 可知，經Oasis HLB 小柱凈化后，SM 和 DHSM 的回收率均能達到 95% 以上。這可能歸因于 HLB 小柱吸附劑的特性：其由親水性 N- 乙烯基吡咯烷酮和親脂性二乙烯基苯按一定比例聚合而成的大孔共聚物構成，具有較高的吸附容量和較強的吸附性能。基于上述結果，最終確定 Oasis HLB 柱為最佳固相萃取柱。

表1 鏈霉素和雙氫鏈霉素質譜參數

注： 為定量離子。

圖 3 不同 SPE 柱對 SM 和 DHSM 回收率的影響

2.1.3 洗脫液選擇

洗脫液的選擇在樣品凈化過程中具有至關重要的作用。異丙醇溶液作為一種強極性溶液，在酸性條件下加入適當濃度的異丙醇能夠提升 SM 和DHSM 在 Oasis HLB 柱上的洗脫效果。本試驗比較了 5% 異丙醇、 10% 甲酸 -5% 異丙醇 - 水、 10% 甲酸 -10% 異丙醇 - 水 3 種洗脫液對 SM 和 DHSM 的回收率的影響。由圖4 可知， 10% 甲酸 -5% 異丙醇-水的洗脫效果優于其他兩種洗脫液，回收率在 95% 以上。因此，最終選擇 10% 甲酸 -5% 異丙醇 - 水作為洗脫溶劑。此外，由于該洗脫液中含有較高的水分，采用氮氣吹干的方式進行濃縮可能會影響處理效率。為避免這一問題，洗脫液被收集后不經任何復溶或稀釋直接過膜，并通過 UHPLC-MS/MS 進行分析。

2.2 色譜柱選擇

SM 與 DHSM 均屬于氨基糖苷類化合物，因其具有較強的極性和堿性特征，在傳統 C₁₈ 、 ΔC₈ 等反相色譜柱上保留能力較弱。因此，在之前的較多研究中，為實現目標檢測物的有效保留，通常會加入七氟丁酸、五氟丙酸、三氟乙酸等離子對試劑，通過與氨基糖苷類化合物結合形成疏水型離子對以延長保留時間，但此類離子對試劑可能對質譜離子源造成污染或損害 [10-12]。目前，氨基糖苷類物質的檢測多使用兩性離子色譜柱 [13]。本試驗選擇 SIELC Obelisc R 色譜柱進行分析，該色譜柱因具有離子基團和較長的疏水鏈，可提供較強的吸附力和調節力，這是傳統反相色譜柱所不具有的。通過優化洗脫梯度，SIELCObelisc R 色譜柱可以有效分離出 SM、DHSM 與雜質組分，所得色譜峰形對稱性良好，峰形尖銳，且保留時間適中，均在 4.16min 出峰。但出峰后有一小部分的拖尾，推測其原因可能與 SM 和 DHSM 的堿性特性有關。因此，本試驗將進一步對流動相的pH 值進行優化。

圖4 不同洗脫液對SM 和DHSM 回收率的影響

2.3 流動相優化

流動相的優化關系到檢測目標物的分離與響應，在無機相中加入甲酸銨或甲酸等試劑可改善色譜峰形、提高響應值和離子化效率 [14]。選取兩種流動相體系（ 20mmol?L^-1 甲酸銨 - 乙腈、 0.5% 甲酸水 -乙腈）進行比較。在 20mmol?L^-1 甲酸銨 - 乙腈流動相體系下，SM 和DHSM 分離效果較差，峰形雜亂，重現性較差，且響應較低；而在 0.5% 甲酸水 - 乙腈 體 系 下，SM（582.3/263.1、582.3/246.2， m/z ）、DHSM（584.2/263.1、584.2/246.2， m/z ）的峰形及對稱性較好，且出峰時間適中，但存在拖尾的情況。為進一步優化流動相性能，對流動相的 pH 值系統調整。當 pH 值為 2.5 時，峰形拖尾的情況得到改善。故最終選擇乙腈 0.5%- 甲酸水（ pH=2.5 ）為流動相。

2.4 方法驗證

2.4.1 相關線性、檢出限和定量限

通過 1.3.1 方法得到的混合標準工作溶液進行測定，以色譜峰面積為縱坐標，以濃度為橫坐標，繪制成標準工作曲線，求回歸方程和相關系數。SM 與 DHSM 在 2.5～ 100.0ng?mL^-1 線 性 關系良好，線性回歸方程分別為 y=39.991x+59.503 、y=73.323x+77.73 ，相關系數 （R²） 分 別 為 0.999 8、0.999 5。 以 信 噪 比 （S/N）?3 為檢出限，信噪比（S/N）?10 為定量限，確定本試驗中測定蜂蜜中SM 與 DHSM 方法的檢出限為 2μg?kg^-1 、定量限為5μg?kg^-1

2.4.2 回收率與精密度

選取驗證過的陰性樣品，添加定量限1 倍、3 倍、10 倍的 SM 與 DHSM 混合標準溶液濃度，分別為5、 15μg?kg^-1 和 50μg?kg^-1 ，每個加標水平進行 6 次平行試驗。由表 2 可知，樣品平均加標回收率（ n=6 ）為 90.0%～ 97.5% ，相對標準偏差（Relative StandardDeviation，RSD）（ n=6 ）為 0.4%～4.2% 。

表2 SM 與DHSM 平均回收率和精密度

3 結論

本研究采用超高效液相色譜串聯質譜法測定蜂蜜中鏈霉素與雙氫鏈霉素。通過系統優化與驗證，確定了樣品前處理條件、色譜柱類型及流動相組成。結果表明，該方法線性關系、檢出限、定量限和回收率均能達到鏈霉素與雙氫鏈霉素檢測的要求。該方法便捷且快速，可用于大批量樣品的，為蜂蜜中鏈霉素與雙氫鏈霉素的檢測提供了可靠的理論依據。

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