QuEChERS-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定干制豇豆中27種農(nóng)藥及其代謝物殘留

Abstract： A method for the determination of 27 pesticides and their metabolite residues in dried cowpea was established by QuEChERS-gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry multi-reaction monitoring mode. After rehydration， acetonitrile extraction， and purification in a dispersion tube， dried cowpeas were determined by gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry multi-reaction monitoring mode， and the matrix matching standard curve was combined with internal standard method for quantitative analysis. The results showed that the residues of 27 pesticides and their metabolites had a good linear relationship between 5.0ng?mL^-1 to 300.0ng?mL^-1 ， the correlation coefficient R² was 0.995 2 to 1.0000 ， the detection limit was 0.2μg?kg^-1 to 3.0μg?kg^-1 ， and the quantitative limit was 0.1μg?kg^-1 to 9.9μg^?kg^-1 . The average recoveries of each target substance were 82.0% to 118.3% ， and the relative standard deviation was 0.8% to 6.3% at the 3 spike levels of 0.1， 0.4， 1.0mg^.kg^-1 . The method was simple， reproducible and sensitive， and was suitable for the rapid detection of 27 pesticides and their metabolite residues in dried cowpea.

Keywords： QuEChERS; gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry; multiple reaction monitoring; pesticide residues and metabolite residues

干制豇豆是以新鮮豇豆為原料，直接自然晾曬或經(jīng)過漂燙、護(hù)色、熱風(fēng)干燥等工藝制成的一種蔬菜制品 [1-2]。在市場(chǎng)上以其營(yíng)養(yǎng)豐富、耐儲(chǔ)性好、風(fēng)味獨(dú)特等特性深受消費(fèi)者喜愛。但豇豆在生長(zhǎng)過程中易受到病蟲害的侵害，因此農(nóng)藥的使用成為提高產(chǎn)量的有效手段 [3]。但農(nóng)藥的不合理使用，可能會(huì)造成殘留超標(biāo) [4]。豇豆農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題較為嚴(yán)重，是有關(guān)部門重點(diǎn)治理的“三棵菜”之一 [5-7]。目前，新鮮豇豆中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)已相對(duì)成熟，包括液相色譜法、氣相色譜法、免疫分析方法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法以及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法等 [8-10]。然而涉及干制豇豆中的農(nóng)藥及其代謝物殘留檢測(cè)的方法研究相對(duì)較少。因此，建立一種適合干制豇豆中多種農(nóng)藥及其代謝物殘留的高通量檢測(cè)方法對(duì)于提升農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全和保障消費(fèi)者健康至關(guān)重要。

傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留檢測(cè)前處理方法包括溶劑萃取、超聲提取、固相萃取等，雖然在一定程度上能夠滿足檢測(cè)需求，但操作過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高 [11-14]。近年來，QuEChERS 方法因其操作流程化、快捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已在果蔬、大米、中藥及茶葉等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用 [15-18]。氣相色譜 - 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法能夠有效降低復(fù)雜樣品中的基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)低豐度目標(biāo)物的精準(zhǔn)定量分析。同時(shí)，檢測(cè)過程中采用的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple ReactionMonitoring，MRM）具有高通量特性，滿足快速檢測(cè)的需求 [19-20]。

因此，本研究通過優(yōu)化樣品前處理，建立一種QuEChERS 結(jié)合氣相色譜 - 三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定豇豆中 27 種農(nóng)藥及其代謝物殘留的方法，以期實(shí)現(xiàn)干制豇豆中農(nóng)藥殘留的快速準(zhǔn)確定量，為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售干制豇豆，采用四分法取樣，粉碎、混勻后置于塑料瓶中于 -18°C 下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

超純水，滿足《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）一級(jí)水要求；丙酮（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙酸乙酯（色譜純）；萃取鹽試劑包（ 6g 無水 MgSO₄ 、 1.5g 乙酸鈉）、分散凈化管 A（ 150mgPSA 、 15mgGCB 、 885mgMgSO₄ ）、分散凈化管B（ ）、分 散 凈 化 管 C（ 150mgPSA 、 150mgC₁₈ 、 900mg MgSO₄ ）；環(huán)氧七氯（內(nèi)標(biāo)， 1000.1μg?mL^-1 ），天津阿爾塔科技有限公司；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： a- 六六六、 β- 六六六、 γ- 六六六、δ- 六六六、倍硫磷、倍硫磷砜、倍硫磷亞砜、苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、狄氏劑、敵敵畏、毒死蜱、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜、甲基異柳磷、氯氟氰菊酯和高效氯氟氰菊酯、樂果、氯氰菊酯和高效氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、氯唑磷、氰戊菊酯和 S- 氰戊菊酯、二甲戊靈、三唑磷、殺撲磷、水胺硫磷、溴氰菊酯（純度均 ?95.0% ），天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890-7000D 氣相色譜 - 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；5810T 離心機(jī)（德國艾本德公司）；M-Q 超純水機(jī)（美國密理博公司）；VORTEX-2 渦旋振蕩器（德國 IKA 公司）；MV 平行濃縮儀（萊伯泰科公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

10.00μg?mL^-1 內(nèi)標(biāo)溶液：取 0.10mL 環(huán)氧七氯于 10mL 容量瓶，用乙酸乙酯定容，于 -18°C 冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別取 27 種農(nóng)藥及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)品 0.05mL 于 10mL 容量瓶，用乙酸乙酯定容，于-18°C 冷凍保存，配制 27 種混標(biāo)儲(chǔ)備液；用空白基質(zhì)將 27 種混標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋為 5.0、10.0、50.0、100.0、 200.0ng?mL^-1 和 300.0ng?mL^-1 含內(nèi)標(biāo)的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品處理

稱取 1g 干制豇豆于 50mL 離心管中，加入超純水靜置 30min ，加入提取溶劑、萃取鹽試劑包及1 顆陶瓷均質(zhì)子，蓋上離心管蓋，劇烈振蕩 1min 后3 000r?min^-1 離心 8min 。吸取 7mL 上清液加入分散凈化管中，渦旋混勻 0.5min 。 3 000r?min^-1 離心5min ，取 2mL 上清液氮吹至近干。加入 2.00mL 含內(nèi)標(biāo)（環(huán)氧七氯 200.0ng?mL^-1 ）的乙酸乙酯復(fù)溶，過0.22μm 微孔濾膜，待上機(jī)測(cè)定。同法選取不含檢測(cè)農(nóng)藥及其代謝物殘留的干制豇豆，制備空白基質(zhì)。

1.3.3 儀器條件

（1）氣相色譜條件。色譜柱：HP-5MS UI 毛細(xì)色譜柱管（ 30m×250μm ， 0.25μm ）；載氣：高純氦氣（純度為 99.999% ）；進(jìn)樣模式：不分流；柱流速：0.9mL?min^-1 ；進(jìn)樣量： 1.0μL ；進(jìn)樣口溫度： 280^°C 。（2）質(zhì)譜條件。電離方式：電子轟擊源；電離能量： 70eV ；進(jìn)樣口溫度： 280^°C ；輔助加熱： 280^°C ；離子源溫度： 230°C ；隔墊吹掃流量： 3mL?min^-1 ；多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描，質(zhì)譜參數(shù)見表 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

為降低干擾離子，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品的高通量、高靈敏度定量分析，本研究選擇MRM 模式，按照所測(cè)農(nóng)藥出峰順序，分時(shí)段進(jìn)行監(jiān)測(cè)。為校正樣品中的變異性和降低分析過程中的誤差，提高定量準(zhǔn)確性，采用環(huán)氧七氯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正。對(duì)環(huán)氧七氯及27 種農(nóng)藥及其代謝物殘留化合物進(jìn)行全掃描，選擇高豐度特征離子為母離子，再進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能，根據(jù)響應(yīng)高低分別確定定量和定性離子對(duì)。經(jīng)優(yōu)化的環(huán)氧七氯及 27 種農(nóng)藥及其代謝物的保留時(shí)間、定量、定性離子對(duì)及碰撞能參數(shù)見表1。

2.2 前處理優(yōu)化

2.2.1 復(fù)水過程中超純水用量的優(yōu)化

干制豇豆含水量低，富含蛋白質(zhì)、脂肪、色素等化合物，若直接用有機(jī)溶劑提取不易滲透，目標(biāo)農(nóng)藥不容易游離，提取液中復(fù)雜組分共溶出物較多，易對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)影響。參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 植物源性食品中 331 種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.121—2021）中對(duì)干制蔬菜測(cè)定前處理過程中的復(fù)水方法，研究復(fù)水過程中超純水用量對(duì)空白樣品加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果表明，超純水用量為 5mL 時(shí)，回收率 ≥120% 的農(nóng)藥及其代謝物殘留數(shù)量較多，可能是提取液中復(fù)雜組分共流出物較多，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)所致；超純水用量為 10mL 時(shí)，回收率在 80%～110% 的農(nóng)藥及其代謝物殘留數(shù)量最多；超純水用量為15mL 時(shí)，需要消耗更多的 MgSO₄ 除水，且回收率不穩(wěn)定，可能是過量的水和鹽類劇烈反應(yīng)放熱所致。因此，確定 1 g 樣品的最佳超純水用量為 10mL 。

表1 27 種農(nóng)藥及其代謝物和環(huán)氧七氯MRM 模式質(zhì)譜參數(shù)

2.2.2 提取溶劑的選擇

在植物源性食品農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，依據(jù)農(nóng)藥的極性和試樣的特點(diǎn)，選擇適宜的提取溶劑至關(guān)重要。常用的提取溶劑有丙酮、乙腈和乙酸乙酯等，本研究對(duì)這些溶劑的提取效果進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丙酮和乙酸乙酯提取液顏色深且油脂較多，乙腈提取液中油脂較少且顏色淺。分別使用 10mL 丙酮、乙腈、乙酸乙酯進(jìn)行提取，得到目標(biāo)農(nóng)藥的平均回收率分別為 86.59% 、 98.40% 、 89.62% 。丙酮呈強(qiáng)極性，能溶解多數(shù)農(nóng)藥，但與水的互溶性強(qiáng)，在鹽析作用下難以分離，所以會(huì)提取更多的色素，高含量的色素可能會(huì)進(jìn)一步影響色譜柱及檢測(cè)器的性能，進(jìn)而影響測(cè)定結(jié)果。乙酸乙酯與水可以部分互溶，但無法完全萃取強(qiáng)極性農(nóng)藥。而乙腈對(duì)農(nóng)藥的溶解度較大且通用提取性強(qiáng)，不易提取雜質(zhì)，鹽析作用下易與水分分離，基質(zhì)干擾少，且所得回收率滿足《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）的要求。因此，本研究選擇 10mL 乙腈作為提取劑。

2.2.3 分散凈化管的選擇

干制豇豆受采摘成熟度、干制方式、工藝、包裝方式及保存條件的影響，其化合物種類、含量、色澤差異較大，為了吸附樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、脂肪酸、碳水化合物及色素等干擾物，提升凈化效果，實(shí)驗(yàn)考察了分散凈化管 A、B、C 對(duì)空白基質(zhì)加標(biāo)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)分散凈化管處理后，凈化液顏色由淺到深依次為 B、A、C，農(nóng)藥平均回收率分別為 83.3% 、 78.5% 、 97.3% 。分散凈化管 A 和 B 顏色淺且回收率低，可能與分散凈化管 A、B 中含較多GCB 有關(guān)。因此，本研究選擇分散凈化管C 進(jìn)行凈化。

2.2.4 提取液凈化體積的選擇

為進(jìn)一步提升凈化效果，研究考察了分散凈化管 C 中固定量的凈化劑對(duì)不同體積干制豇豆提取液的凈化效果。分別取 5、7、 9mL 干制豇豆提取液加入分散凈化管 C 中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在凈化劑量不變的條件下，溶液顏色逐漸加深，目標(biāo)農(nóng)藥的平均回收率依次升高，分別為 96.5% 、 98.4% 和 103.5% 。提取液為 9mL 時(shí)，回收率最高，但顏色較深的溶液中含有更多的色素，測(cè)定時(shí)容易污染氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，可能導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。因此，為確保凈化效果，減少對(duì)檢測(cè)儀器污染的同時(shí)降低潛在的基質(zhì)效應(yīng)影響，本研究選擇 7mL 提取液進(jìn)行凈化。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限

為降低基質(zhì)影響，采用基質(zhì)匹配法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)農(nóng)藥的濃度與環(huán)氧七氯濃度的比值為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)農(nóng)藥響應(yīng)與環(huán)氧七氯響應(yīng)比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以空白基質(zhì)產(chǎn)生信噪比的3 倍、10 倍分別計(jì)算檢出限、定量限，27 種目標(biāo)農(nóng)藥及其代謝物的線性方程、檢出限、定量限見表2。27 種農(nóng)藥在 5.0～300.0ng?mL^-1 線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù) R² 在 0.995 2～ 1.000 0 。檢出限在 0.2～ 3.0μg?kg^-1 、定量限在 0.1～9.9μg?kg^-1 ，滿足多數(shù)農(nóng)藥殘留篩查的要求。

2.3.2 準(zhǔn)確度與精密度

向空白基質(zhì)中分別添加低（ 0.1mg?kg^-1 ）、中（ 0.4mg?kg^-1 ）、高（ 1.0mg^.kg^-1 ）3 個(gè)水平農(nóng)藥及其代謝物殘留，考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表 3。農(nóng)藥及其代謝物殘留在 3 個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為 82.0%～ 118.3% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RelativeStandard Deviation，RSD）為 （ n=6 ），符合 GB/T 27404—2008 中相應(yīng)指標(biāo)的要求，表明本方法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本文建立的測(cè)定 5 批次市售干制豇豆中27 種農(nóng)藥及其代謝物殘留。結(jié)果表明，5 批次樣品中共檢測(cè)出 2 種農(nóng)藥，分別是倍硫磷及其代謝物（ 0.37mg^?kg^-1 ）、 三 唑 磷（ 0.028mg^.kg^-1 ）， 其 余25 種農(nóng)藥均未檢出。

3 結(jié)論

本研究以干制豇豆為樣品基質(zhì)，通過優(yōu)化QuEChERS 前處理，結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了一種可同時(shí)測(cè)定干制豇豆中 27 種農(nóng)藥及其代謝物殘留的方法。該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、重復(fù)性好，適合于干制豇豆中27 種農(nóng)藥及其代謝物殘留的快速定量分析，可為干制豇豆的市場(chǎng)監(jiān)管提供技術(shù)支持。

（續(xù)表 3）

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