從自體廢棄軟骨組織中提取軟骨細胞的方法探究

DOI：10.16424/j.cnki.cn32-1807/r.2025.05.006

[中圖分類號]R329.2 [文獻標志碼]A [文章編號] 1674-7887（2025）05-0435-04

Exploration of methods for extracting chondrocytes from autologous discarded cartilage tissue*

XUERunnan1**，YAOWanglin，ZHUWenfeng2**，XIAOChang hao’，GUYuanyang1 （'Department of Orthopedics， AfiliatedHospital6ofNantongUniversityYanchengThirdPeople'sHospital，Jangsu2245;DepartmentofOrtopedis， Affiliated Qidong Hospital of Nantong University）

[Abstract]Objectie：Toinvestigateamethodfor extractingpurechondrocytesfromautologous discarded cartilage tissue. Methods：（1）Anoriginalcartilagecolectiondevicewasused tocolectdiscardedcartilagetissuefromcartilagedefectareas in knee jointcartilageinjurypatientsscheduledforautologouschondrocyte transplantation，folowedbychondrocyteextraction. （2）Cell morphology was observed under inverted phase contrast microscopy to determine conformity with chondrocyte morphology.Toluidineblue staining wasperformed toverify normal chondrocyte staining characteristics.Immunohistochemical staining was used to identify type collagen-secreting chondrocytes.Results： Cartilage mass： 72 mg; cell concentration： 1.736 |×| （20 （20 10⁴ cels/mL.Primary celsappeared spherical，uniformly sized，suspended inculture medium with peripheral refractivity. After48hourculture，celsgrewinpolygonal shapeswithcolony-forming characteristics，consistentwithchondrocytegrowth paterns.Toluidine bluestainingshoweddark bluenuclei，light bluecytoplasm，and clearlyvisible contours，conforming to chondrocyte staining features.Immunohistochemical staining revealedyelow-brownnuclei，brown-yelow extracellularmatrix， andyellow-brownganulesaroundcels，indicating typeIcollagensecretion.Conclusion：Theoriginal“blade-filteraspirator\" deviceenables eficient intraoperative recoveryofdiscarded cartilage.Thestepwiseenzymaticdigestion method sucesfuly extractshigh-puritychondrocytes，providinganovelcell sourceforautologouschondrocytetransplantationtechnologywhile avoiding iatrogenic injury caused by traditional harvesting.

[Key words] cartilage tissue; chondrocyte; cartilage defect; autologous chondrocyte transplantation technology

軟骨是一種結締組織，由富含膠原蛋白和蛋白多糖的基質及單一細胞類型（軟骨細胞）組成I。因軟骨缺乏血管和神經，僅通過擴散獲得營養，其損傷后不具備自我修復能力。軟骨損傷、缺損是膝、踝等大關節疼痛的重要原因[3。軟骨損傷目前仍無絕對的治愈方法。傳統微骨折技術使用再生的為纖維軟骨，其生物力學和透明軟骨相差很遠。自體軟骨細胞移植技術較傳統微骨折技術具有明顯優勢[5-I0]。但這項技術受限于供體、軟骨缺損面積、易退變等問題。患者自體軟骨組織通常取自膝關節的非負重區[11-12]，可造成醫源性損傷，因此該技術未被廣泛接受，限制了其臨床應用。本研究使用自制裝置在對患者關節軟骨損傷部位清理過程中獲取組織，提取軟骨細胞，為軟骨組織及軟骨細胞的來源提供一種新的思路。

1材料與方法

1.1一般資料選取在2024年11月23日就診的行關節鏡微創下清理、探查的膝關節軟骨損傷Ⅲ～V級患者1例。術前完善膝關節X線檢查、MRI檢查和血液檢查以排除骨性關節炎、風濕病和傳染病。

1.2材料與試劑DMEM-F12培養液、胎牛血清（普諾斯）， 0.25% 胰蛋白酶 .0.2% Ⅱ型膠原酶、PBS、臺盼藍染液 .1% 甲苯胺藍染液 .4% 多聚甲醛（LEAGENE）、DMSO（索萊寶）（Biosharp），無水乙醇（北京化工廠），2.5% 戊二醛 .1% 酸（麥克林）。

1.3方法

1.3.1組織的獲取大腿上1/3扎止血帶，全身麻醉成功后，消毒、鋪單，置人關節鏡頭，探查關節腔，確定關節軟骨損傷部位后進行關節清理。采用一次性使用無菌輸血器（蘇云醫療器械有限公司，型號：A1，批號：20240521）自制刨刀-過濾網-吸引器裝置（圖1）：將輸血器帶氣針的一端沿滴斗上端剪掉，剩余部分連接清理關節軟骨的刨刀，末端接吸引器，含雜質的軟骨組織被吸人時軟骨組織即被附著于滴斗里的過濾網上，術中操作嚴格遵守無菌原則。然后用無菌剪刀分離濾網，分離出滑膜等雜質，初步篩選出軟骨組織，將所獲取的組織裝人含PBS、抗生素的無菌 50mL 離心管中。樣本采集符合《赫爾辛基宣言》要求，經鹽城市第三人民醫院倫理委員會審核（倫理-2024-127）。

圖1自制收集裝置“創刀-過濾網-吸引器”

1.3.2細胞的提取 （1）用含雙抗（抗青霉素-鏈霉素）的PBS漂洗軟骨組織3次后，留存組織轉入 10mL 離心管（1號管）；（2）1號管內加入和留存組織體積相等的 0.25% 胰蛋白酶，放入振蕩器 37^°C 下 205r/min 震蕩 0.5h ;（3）相等體積含有胎牛血清的培養基即刻加入1號管終止胰酶消化， 1300r/min 離心 5min ，獲得沉淀的組織；（4）取沉淀組織兩倍體積的 0.2% ⅡI型膠原酶加入1號管， 37°C 下 205r/min 振蕩消化1h;（5）1 號管 1300r/min 離心 5min 后，將含細胞的液體吸入另一 10mL 離心管（2號管），并加人相等體積含有胎牛血清的培養基終止消化；（6）2號管1800r/min 離心 5min 后，吸管吸除液體獲得沉淀的細胞;（7）重復上述4～6步驟5次。

1.3.3細胞的計數與鑒定 （1）將沉淀的細胞加 10mL 培養基，移液槍均勻吹打后取2滴液體采用細胞計數器計數；（2）觀察細胞的大體形態，培養 ^48h 后觀察貼壁后的細胞形態；（3）甲苯胺藍染色鑒定：將1/3細胞放入含蓋玻片的培養皿中培養 ^48h ，用不含抗生素的PBS緩慢沖洗2次，并用 4% 多聚甲醛溶液固定 20min?0.1% 甲苯胺藍染液浸泡 2h 后再用 90% 無水乙醇沖洗[13-14]，鏡下觀察；（4）Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定：室溫下用 3% 過氧化氫溶液孵育細胞 10min ，PBS沖洗2次，后加入血清，孵育10min ，去除血清后加入一抗（兔抗人Ⅱ型膠原），4^°C 過夜;PBS沖洗，加入二抗孵育 10min 后DAB顯色，以蘇木精染液復色，無水乙醇脫水后封片，鏡下觀察[]。

2結果

2.1軟骨細胞計數實驗患者軟骨質量為 72mg 細胞濃度約 1.736×10⁴ 個 /mL 。

2.2原代軟骨細胞原代細胞呈球形，大小均一，懸浮于培養基中，周邊具有一定的折光性（圖2A）。培養 ^48h 后，細胞呈多角形生長，并表現出集落生長特性，符合軟骨細胞的生長特點（圖2B）。

2.3細胞甲苯胺藍染色鑒定細胞貼壁后用甲苯胺藍染色，結果顯示細胞核呈深藍色，細胞質顏色較淡，細胞輪廓清晰可見，符合軟骨細胞染色特征（圖2C）。

2.4Ⅱ型膠原免疫組化染色鑒定細胞貼壁后行Ⅱ型膠原免疫組化染色，細胞核呈黃褐色，細胞基質呈棕黃色，黃褐色顆粒在細胞周圍出現，提示該細胞能分泌Ⅱ型膠原（圖2D）。

圖2原代培養細胞形態

注：A，剛提取的原代細胞形態；B，培養 ^48h 后原代細胞形態； C，細胞甲苯胺藍染色；D，Ⅱ型膠原免疫組化染色。a，細胞核； b，細胞基質。A ，Bar=100μm ;B～D， Bar=50μm 0

3討論

隨著膝關節軟骨損傷人數的不斷增多，臨床出現了有望治愈軟骨損傷的自體軟骨細胞移植技術，13]。但自體軟骨組織的來源成為科研道路絆腳石。目前軟骨細胞多為動物來源[14-15]，對人體的適用性和兼容性尚不明確。本研究探索利用自制裝置從自體軟骨損傷區獲取軟骨組織，并提取軟骨細胞，從而解決自體軟骨的來源問題。本研究成功應用了自制的“刨刀-過濾網-吸引器”一體化裝置進行術中軟骨組織的收集。該方法的核心優勢在于高效、安全地回收了原本可能被廢棄的軟骨組織，為后續高質量的軟骨細胞提取奠定了關鍵基礎。相較于傳統術中直接丟棄或繁瑣的單獨收集方式，該裝置的集成設計實現了術中操作與組織回收的同步化。其內置濾網有效攔截并富集了刨削產生的軟骨碎片，顯著減少了組織損失，提高了可用于細胞提取的軟骨總量。同時，利用一次性無菌輸血器組件并嚴格遵循無菌操作原則，最大程度地保障了收集過程的無菌性，有效降低了后續細胞培養的污染風險。初步富集后的組織也簡化了實驗室端的篩選流程。這種簡便、高效且安全的收集策略，是本研究能夠順利獲取足量、合格軟骨細胞樣本的重要環節，對于提高關節鏡下軟骨細胞移植等技術的效率和成功率具有實用價值。這種收集方法安全方便，軟骨組織損失少，極大程度地保證后續軟骨細胞的順利提取。

本研究獲取的軟骨組織源于關節鏡下軟骨損傷區的清理術，并非純凈的透明軟骨組織，常混雜脂肪組織、滑膜組織等雜質。鑒于雜質細胞活力較低，本研究采用優化的階梯酶消化策略以最大限度保護目標軟骨細胞并提高純度：首先應用低濃度胰蛋白酶（0.25%） 進行短時 （0.5h） 消化，旨在特異性清除混雜的軟組織雜質，同時將酶對軟骨細胞的潛在損傷降至最低；隨后，采用 0.2%I 型膠原酶進行5次 ?1h/ 次的重復消化，以溫和、可控地分解軟骨特異性細胞外基質（主要成分為Ⅱ型膠原），逐步釋放軟骨細胞。此分步、低濃度、短時程的酶處理方案，顯著區別于常規體外實驗報道的從動物軟骨直接使用Ⅱ型膠原酶持續消化 6～8h^[11-12] 。核心優勢在于：通過嚴格控制酶種類、濃度及作用時間，特別是胰蛋白酶的預處理步驟，有效規避了酶對珍貴且有限的臨床廢棄樣本中軟骨細胞的過度損傷，從而成功實現了從混雜、微量組織中高效分離高純度、高活性軟骨細胞。通過觀察，所提取的細胞在形態學及生長特性上均符合軟骨細胞特征：呈聚集生長的多角形細胞。正常軟骨細胞外基質富含糖胺聚糖，該物質為酸性黏多糖（而非堿性糖聚合物）。甲苯胺藍染液可與糖胺聚糖中的酸性基團結合而顯色，因此本研究采用甲苯胺藍染色法對所獲細胞進行鑒定。同時，鑒于軟骨組織主要由軟骨細胞及其特異性表達的Ⅱ型膠原構成，進一步采用免疫組織化學法對Ⅱ型膠原進行染色結果表明該細胞具有分泌Ⅱ型膠原的能力。綜上，通過甲苯胺藍染色與Ⅱ型膠原免疫組化染色兩種方法鑒定，確認所獲得的細胞為純凈的軟骨細胞。

本研究成功建立了一種從關節鏡下廢棄軟骨組織中高效提取高純度軟骨細胞的方法體系。其核心創新在于：自主研發的“刨刀-過濾網-吸引器”一體化裝置實現了術中軟骨碎片的同步無菌化回收，顯著減少組織損失并規避傳統取材的醫源性損傷；同時，針對混雜組織特性設計的階梯酶消化策略通過精準控制酶作用強度與時長，在清除脂肪、滑膜等雜質的同時最大限度保護軟骨細胞活性，最終獲得高純度、高活性的功能性軟骨細胞。該方法為自體軟骨細胞移植術提供了新型細胞來源，具有重要臨床轉化價值。

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[收稿日期]2024-12-04