林飛燕,陸 春

(中山大學第三附屬醫院皮膚病與性病科,廣東廣州 510630)

生物被膜(Biofilm,BF)是微生物在生長過程中附著于物體表面而形成的由微生物的細胞及其分泌的聚合物等所組成的膜樣多細胞復合體,多項研究表明生物被膜的形成可以增強微生物對環境和抗生素的耐受性,目前生物被膜的形成被認為是微生物耐藥尤其是多重耐藥的機制之一[1]。在耐藥機制的研究中,微生物的耐藥性通常由某耐藥基因或基因突變的編碼產物所介導,相對而言生物被膜形成介導的耐藥機制則十分復雜。目前研究發現,耐藥基因尤其是藥物外排泵編碼基因和生物被膜在微生物耐藥機制中有著復雜而密切的關系:生物被膜初步開始形成后,菌株基因表達即開始發生變化以適應新的生長環境,這種變化由獨特的基因表達模式所控制,稱為生物被膜表型,生物被膜內環境對多種基因表型具有特殊的調控作用;在生物被膜形成過程中,某些耐藥基因及其產物可能在影響生物被膜形成、增強生物被膜耐藥性、協助生物被膜內部信號傳導以及調控生物被膜毒力、活性等多方面發揮不同作用。本文分別從生物被膜對藥物外排泵、耐藥基因的影響,藥物外排泵對生物被膜的影響,以及藥物外排泵和微生物生物被膜共同的調節因素等方面,對近年來的相關研究進展作一綜述。

1 生物被膜對藥物外排泵、耐藥基因的影響

1.1 生物被膜的內環境特點及其與藥物外排泵的關系

生物被膜中的營養成分和氧濃度自外向內呈梯度下降,代謝產物濃度、滲透壓則逐漸上升,生長環境的差異使生物被膜外層與內層微生物體積大小和代謝活性存在顯著差異,內層的微生物生長狀態較外層微生物緩慢也稱饑餓狀態;目前大多數抗生素均是針對生長期的微生物,當使用抗菌藥物治療時,生長快速的生物被膜外層或表層微生物最敏感,首先被殺死,而大多數抗生素都不能很好地殺滅生長緩慢或停滯的處于饑餓狀態的微生物,這是生物被膜耐受抗菌藥物和持續存在的重要機制之一[1]。也有研究指出生物膜菌株和游離菌株即使生長速度相同,耐藥水平依然差異很大:銅綠假單胞菌的游離株和膜內株對妥布霉素和環丙沙星的敏感性隨生長速度的加快而增加,但在較高的生長速度下,浮游菌比膜內細菌對環丙沙星更敏感[2]。與此同時,生物被膜深層微生物累積的高濃度代謝產物還可以增強外排泵的作用,如大腸埃希菌生物被膜中的代謝產物可誘導AcrAB-TolC外排泵對萘啶酮酸泵出作用增強,而某些藥物外排泵(主要為多藥耐藥外排泵)不僅僅以抗菌藥物為底物,還可以將微生物的代謝產物、毒性物質、酶類、致病因子等排出胞外,這可能有助于生物被膜內饑餓狀態微生物維持其活力與毒力[3]。

1.2 生物被膜中耐藥基因的表達及對耐藥性的影響

目前對生物被膜中相關耐藥基因的轉錄、翻譯水平的定量監測,是生物被膜耐藥機制研究的一大熱點。在生物被膜形成過程中,耐藥基因表達的上調有助于生物被膜對抗菌藥物抵抗力的增強,其中排泵基因的影響最為顯著:在白色念珠菌生物被膜形成過程中,表面可結合氮雜茂的受體數目與懸浮生長時相近,但氮雜茂外排泵的編碼基因CDR的表達水平比懸浮生長時上調,提示外排泵基因的高度表達對白色念珠菌生物被膜的抗藥性產生有一定作用[4]。在銅綠假單胞菌生物被膜的耐藥機制中,有研究證實其對阿奇霉素和對妥布霉素的耐藥性分別是由MexCD-OprJ外排泵和MexXY-Op rM外排泵高表達所致[5-6],而PA1874-1877編碼的外排系統對于銅綠假單胞菌生物被膜多重耐藥(耐受妥布霉素、慶大霉素、環丙沙星)具有重要作用[7]。但耐藥基因高表達并不意味著耐藥性必然升高,有研究發現盡管銅綠假單胞菌生物被膜中MexAB-Op rM外排系統也存在過度表達,卻并未對β-內酰胺類抗生素顯示出耐藥性增強[8]。生物被膜耐藥性對藥物外排泵的依賴性并非始終如一,如銅綠假單胞菌生物被膜MexAB-Op rM基因的表達水平,只能影響其對低劑量氧氟沙星的耐藥性[9]。另外,耐藥基因在生物被膜形成的不同時期其表達水平也并不一致:白假絲酵母菌生物被膜的成熟程度與耐藥性增強有明顯正相關性,有研究發現外排泵編碼基因CDR1、CDR2和MDR1在白念珠菌生物被膜形成的早期(<12 h)表達增多,可能參與耐藥,但在成熟期(>12 h)以上3種基因缺失的菌株也達到了與攜帶耐藥基因的菌株相同的耐藥水平[10];也有研究指出,與早期生物被膜相比,白色念珠菌成熟生物被膜菌株的藥物流出泵基因CDR1表達上調,表達水平改變活躍,而MDR1基因的表達在生物被膜的整個成熟過程中基本維持不變[11]。此外,耐藥基因表達并非一味增強,出現上調或下降均有可能,有研究發現大腸埃希菌的某突變體雖然可以形成正常的生物被膜結構,但形成過程中包括編碼多藥外排泵的wasyhcQ基因在內的22種基因均出現了表達下調[12]。

1.3 生物被膜中的基因突變和表型改變

生物被膜內微生物突變頻率明顯高于浮游狀態的微生物,這意味著高突變微生物亞群的存在,突變結果對生物被膜中微生物的耐藥性、黏附力、致病力等多種生物學特性的增強具有重要作用[13],例如銅綠假單胞菌菌株對環丙沙星的耐藥性被證明是由gyrA基因和2個外排系統(Mex-CD-OprJ和MexEF-Opr N)的突變導致[14];表皮葡萄球菌的luxS突變株形成生物被膜的能力增強,且在大鼠模型中生物被膜感染加重[15]。生物被膜中氧化壓力的不平衡導致微生物出現氧化應激,被認為是引起生物被膜內基因突變的重要原因[16]。生物被膜形成后某些基因可出現明顯的表型改變,從mRNA水平和蛋白水平都和游離狀態的微生物存在很大區別,如大腸埃希菌生物被膜有10%基因表達明顯不同于浮游細菌,其中1.9%基因表達活性上調或下調2倍以上[17]。

1.4 生物被膜促進細菌間耐藥基因的水平轉移

由于生物被膜內微生物彼此密切接觸,菌體間基因的水平轉移更加容易,整合酶的整合功能更活躍,整合子在生物被膜狀態下也可進行更活躍的基因捕獲[18],因而生物被膜內微生物基因和表型更容易復雜化和多樣化,更易導致微生物出現高度多重耐藥性。有人從腎病患者尿管上的混合微生物生物被膜中分離出高度耐受萬古霉素的金黃色葡萄球菌,該菌同時耐受耐氨基糖苷類、喹諾酮類、大環內酯類、青霉素、四環素等多種抗菌藥物,PCR分析該菌的耐藥基因,發現該菌攜帶有由多種耐藥基因組合而成的多重耐藥基因簇,包括四環素耐藥基因tet基因,er mB-aadE-sat4-aphA-3,大環內酯類外排泵基因m srA基因,以及氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-aph(2′′)-Ia等,該研究認為混合微生物生物被膜中細菌之間的密切接觸為外源耐藥基因的水平轉移提供了便利,同時生物被膜微環境增強了這些耐藥基因的作用[19]。

1.5 QS系統對外排泵的影響

QS系統(quorum-sensing,群體感應系統)是一種微生物間信息傳遞機制,微生物通過互相傳遞一種胞外自誘導分子(autoinducer,A I)的濃度來控制整個微生物群體的行為。當A I的濃度隨著微生物群體的密度不斷升高并達到一定閾值時,就會滲透到細胞內和轉錄調節蛋白結合,形成轉錄調節蛋白-信號分子聚合物,此聚合物能夠結合到特定的DNA序列上,啟動靶基因表達。QS系統能夠使原本互相獨立的單個游離的微生物統一步伐,群集性地對外界刺激做出反應,顯示出單個微生物所不具有的生理功能和生態特征,能夠有力的增強微生物群體的生存能力[1]。QS系統參與微生物很多生物學功能的調控如:細菌聚集性、游動性、生物被膜形成,微生物抗生素合成,毒性因子表達,表面活性物質產生,胞外酶產生,質粒的結合轉移等[20]。同時,QS系統還參與影響耐藥基因表達和微生物的耐藥性,如脆弱類擬桿菌的LuxR I系統可以調節bmeB外排泵的表達[21],表皮葡萄球菌QS系統中的agrD和RNAⅢ參與介導細菌對紅霉素的耐藥性增加[22]。

2 藥物外排泵對生物被膜的影響

2.1 外排泵參與生物被膜及QS系統的形成

微生物形成生物被膜是一個動態的過程,包括微生物的初始黏附,微生物的表面錨定,微生物繁殖、聚集成微小菌落,形成復雜的蘑菇狀成熟生物被膜,生物被膜內微生物的分離[23]。最近發現外排泵可以輔助細胞間的信號分子傳導,協助生物被膜形成QS系統:類鼻疽假單胞菌的BpeABOpr B外排泵是一個誘導外排系統,bpeR是類鼻疽假單胞菌生物被膜產生的A I中的一種,研究發現BpeAB-Opr B外排泵是合成bpeR所必需的,其功能影響了自誘導分子合酶BpsI的表達[24]。需要注意的是,外排泵的存在并不總是有利于微生物生物被膜,有研究發現SmeDEF外排泵過表達造成微生物營養的損耗,由此抑制了微生物生長和毒力[3]。

2.2 藥物外排泵和生物被膜外基質對抗菌藥物的抵御作用

生物被膜外的基質成分可以減慢或阻止抗生素滲透到生物被膜中,例如氟喹諾酮類抗菌藥物可以緩慢滲透入生物被膜的胞外基質,且因其在基質中濃度過低不能有效發揮作用,還易誘發β-內酰胺酶的表達而被水解[1],這類機制可能取決于基質中多糖物質的黏附、正負電荷的吸附、抗菌素滅活酶的鈍化作用[25]以及迂曲的滲透途徑[26]。但有些藥物雖能通過外基質但仍無療效,例如氟化喹啉可以輕易穿透大部分微生物生物被膜,氨芐青霉素也可以穿透缺乏β-內酰胺酶的肺炎桿菌生物被膜,但生物被膜深層的微生物并不能被清除,這可能得益于藥物外排泵的表達上調,協助微生物將滲透入生物被膜的抗菌藥物排出細胞外,銅綠假單胞菌的MexAB-Op rM和MexCDOprJ外排泵已被證明是介導生物被膜耐藥特別是對大環內酯類阿奇霉耐藥的具體機制[27]。

2.3 抵抗免疫清除

在宿主體內,生物被膜中大量的黏性基質包裹著微生物,形成了一個物理屏障,可以將微生物和機體免疫系統隔開,使機體的吞噬細胞和殺傷細胞及其所分泌的酶不能對微生物產生有效的攻擊;生物被膜還可以調節宿主體內細胞因子的產生、抵御免疫細胞的吞噬調理作用,如銅綠假單胞細菌生物被膜可增加γ干擾素分泌從而抑制白細胞吞噬作用[28]。研究發現藥物外排泵也可參與微生物對宿主免疫系統的作用,如在桿狀細菌李斯特菌中,MdrL、Md rM、MdrT外排泵轉運蛋白可影響宿主的免疫應答,調節細胞因子如Ⅰ型干擾素的合成,這種作用可能是由于外排泵釋放了與宿主細胞因子相似或接近的物質分子干擾所致[29]。

3 對藥物外排泵和微生物生物被膜同時有調控作用的物質

現已發現某些物質可對微生物生物被膜和藥物外排泵同時具有調節作用:四環素可同時促進白色念珠菌生物被膜形成和外排泵表達,在培養生物被膜同時加入一定濃度的四環素,可通過增加菌絲出芽對白色念珠菌生物被膜的形成有輕度促進作用,同時上調了CDR1外排泵的表達[30];脆弱類擬桿菌如暴露于0.15%膽汁鹽或非結合型膽汁鹽中,可增加RND型外排泵編碼基因和主要外膜蛋白OmpA的表達,并表現出微生物聚集性、對腸上皮細胞的黏附力和生物被膜形成均顯著增加[31]。有研究發現添加外排泵抑制劑如甲硫達嗪、β-鹽酸苯甲酰精氨酰萘胺(PAβN)或1-(1-萘甲基)哌嗪,可以減弱相對應的外排泵的功能,抑制大腸埃希菌的生物被膜形成,并增強抗菌藥物的殺菌作用[32];而外排泵抑制劑PAβN和鐵螯合劑(如2,2′-聯吡啶,乙酰氧肟酸,乙二胺四乙酸即EDTA等)聯合作用,可以抑制銅綠假單胞菌細菌生長和生物膜的形成[33]。

4 展 望

綜上所述,藥物外排泵和微生物生物被膜在微生物耐藥機制中扮演著密切相關的重要角色:微生物生物被膜形成后常導致微生物耐藥性增強、多重耐藥性,并常增強微生物對環境的抵抗力,使之難以清除而導致臨床相關感染的難治性,而藥物外排泵的存在又對生物被膜的生長、耐藥性等具有促進增強作用,二者共存使常規抗菌藥物的療效面臨著嚴峻考驗。目前,迫切需要合適的藥物對微生物生物膜這一特點進行有效治療。像外排泵抑制劑這樣能同時抑制藥物外排泵活性和生物被膜生長的藥物或化學成分,能夠更有力地清除微生物生物被膜,削弱藥物外排泵的作用,降低微生物抗藥性,對生物膜感染所致的臨床疾病具有更大的治療潛力。

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