毛栓菌漆酶的分離純化及酶學性質研究

關艷麗,華 霜,趙新海,張慶華,鐘麗娟,朱巍巍,吳紅艷

(1.遼寧省微生物科學研究院,遼寧朝陽 122000;2.沈陽農業大學,遼寧沈陽 110161)

漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,1883年日本人Yoshida首次從漆樹分泌物中發現,因而得名。它在植物的多種生物合成和降解中都有作用。隨著研究工作的深入,人們發現它廣泛存在于自然界多種植物和菌類的分泌物中,并且漆酶在植物中的生物學功能主要是參與木質素合成、細胞壁降解[1]、脫毒、創傷保護和形態分化調控:在工業中,漆酶廣泛應用于造紙制漿,果汁、啤酒的澄清,生漆干燥成膜,毛發染色,固定化酶電極,免疫學分析,有機合成和環境保護中有毒廢物的處理等很多領域[2]。相對于木素過氧化物酶(Lip)和錳過氧化物酶(MnP)更成為研究的熱點。本文對毛栓菌所產生的漆酶進行分離純化,并對其酶學性質進行研究,為漆酶的生產、應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 毛栓菌(Tram etes trogii),由遼寧省微生物科學研究院保存。

1.1.2 培養基 固體培養基為PDA培養基;液體培養基為最佳產酶培養基[3]:玉米面3.5%,豆餅粉4.0%,KH2PO40.1%,MgSO40.15%,VB10.04%。

1.1.3 主要試劑 ABTS(Sigma公司);Sephadex G-100;DEAE-Sepharose Fast Flow(Phar macia公司);考馬斯亮藍G250和考馬斯亮藍R-250(Amresco進口分裝);SDS(Sigma進口分裝);牛血清白蛋白(BSA,Sigma進口分裝);尿素(Sigma公司);丙烯酰胺(Amresco進口分裝);TEMED(N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(BB I公司進口分裝);DTT(Amresco進口分裝);愈創木酚(Amresco進口分裝);其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 漆酶活性的測定 測定方法參照文獻[4]。

1.2.2 蛋白質含量的測定 采用考馬斯亮藍G-250比色法[4]。

1.2.3 漆酶同工酶酶譜檢測 采用SDS-PAGE凝膠電泳。漆酶譜帶檢測:電泳結束后,取下凝膠,用刀片沿泳道切取兩部分:一部分用G-250染色,檢測蛋白譜帶;另一部分先用蒸餾水沖洗,放入含0.1 mol/L HAC-NaAC(pH 4.5)0.4 mmol/L愈創木酚的溶液中,30℃反應30 min,反應結束后兩部分進行對照,與愈創木酚反應而著色的帶為漆酶帶。

1.2.4 漆酶的分離純化 ①粗酶液的制備:在含200 mL液體培養基的500 mL三角瓶中,接種3個菌塞(用打孔器制成直徑10 mm厚2 mm的菌塞),于28℃、140 r/min恒溫培養箱中培養7 d,將發酵液8 000 r/min,離心10 min。80%硫酸銨沉淀去除雜蛋白,獲得目標蛋白沉淀。將沉淀溶解于2倍體積的10 mmol/L PBS(pH 6.0)緩沖液中,8 000 r/min低溫離心10 min,除去不溶的雜蛋白,將上清液過夜透析脫鹽平衡得到粗酶液備用;②DEAE-Sepharose層析:將粗酶液加到已用PBS平衡過的DEAE Sepharose Fast Flow柱(3.6 cm×40 cm)上,用0.1～1 mol/L以12滴/min流速洗柱并收集洗脫液,每管收集量2 mL。分別測定各管洗脫液在595 nm處的吸光度和420 nm處的漆酶活性,收集合并酶活性峰值組份于透析袋內,用PEG20000進行濃縮后,4℃保存。

1.2.5 酶學性質 ①分子量的測定:將樣品及已知分子量的標準蛋白進行SDS-PAGE,分離膠濃度10%,濃縮膠濃度5%,以低分子量蛋白質Marker為標準,考馬斯亮藍R-250染色;②最適反應溫度及熱穩定性[5]:在不同溫度下按照標準方法測定其相對酶活力(酶活力最高者為100%)。取酶液在不同溫度下分別保溫30 min,然后迅速冷卻至室溫,測殘余酶相對活力(以未保溫的酶液的酶活為100%);③最適反應pH及酸堿穩定性:將酶液分別加在不同pH(2.2～7.0)磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中,按酶活力測定方法測定不同pH下的相對酶活力(酶活力最高者為100%)。酶液在不同pH緩沖液中28℃保溫30 min,然后迅速冷卻至室溫,分別測定其殘余酶活(以未保溫酶液的酶活為100%);④金屬離子對酶活力的影響:分別配制5 mmol/L的NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、FeCl3、CuSO4·5H2O、MnCl2、ZnSO4·5H2O、AgNO3鹽溶液[6]。將酶液加入到以上鹽溶液中,加入ABTS啟動反應,立即進行漆酶活力測定,以不加離子的反應液為對照;⑤抑制劑對酶活性的影響:用含DTT、EDTA、DMSO、SDS的0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 4.0)與一定量酶液混合,加入ABTS啟動反應,分別測定其酶活力。

2 結果與分析

2.1 漆酶的分離純化

粗酶液經鹽析、透析和濃縮后,上DEAE Sepharose Fast Flow柱層析,NaCl線性梯度洗脫,記錄洗脫的蛋白質曲線,對各收集管進行酶活測定,記錄結果見圖1。由圖1可見2個峰,按其洗脫先后順序分別命名為LacA、LacB。分別將2峰收集合并,用ABTS分別檢測各峰值處洗脫液,均顯示出漆酶活性,說明毛栓菌產生的漆酶為2種組分的同工酶。LacA和LacB經純化后比活力分別為11.85、4.52 U/mg;純化倍數分別為12.88、4.91;回收率分別為17.1%、2.74%。

2.2 漆酶同工酶酶譜檢測及分子量測定

毛栓菌發酵液經硫酸銨沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow層析分離、純化后,得到的酶液進行SDS-PAGE電泳,采用活性染色和考馬斯亮藍染色,結果見圖2。由圖2可見,純化后得到蛋白質條帶單一,說明該漆酶已達電泳純。從電泳結果可以看出毛栓菌有2種漆酶同工酶,自上而下分別為LacA、LacB。由SDS-PAGE電泳測得LacA、LacB分子量分別約為54.6和17.7 ku。近年來,有很多不同來源的漆酶得到提純,并發現不同菌株分泌的漆酶其表觀分子量差異很大,但一般為59～390 ku,真菌漆酶的分子量在59～80 ku之間[7]。本試驗菌株同工酶分子量均不在此范圍內,初步認為是2種新的漆酶同工酶。

圖1 毛栓菌漆酶DEAE sepharose Fast Flow層析曲線Fig.1 DEAE Sepharose Fast Flow chromatography curve of laccase from Trametes trogii

圖2 漆酶的SDS-PAGE檢測圖Fig.2 SDS-PAGE of laccase and proteins

2.3 最適反應溫度及熱穩定性

在不同溫度下LacA、LacB的酶活測定結果見圖3,熱穩定性分析結果見圖4。由圖3、4可知,毛栓菌漆酶LacA、LacB的最適反應溫度分別為50、60℃,在30～70℃范圍內其酶活受溫度影響較大,且隨溫度增高失活率逐漸增加。在40℃以下保溫4 h剩余相對酶活仍維持在50%以上,而在最適溫度以上保溫4 h剩余相對酶活都在35%以下,這說明漆酶LacA、LacB在40℃以下具有較好的熱穩定性,但高于60℃很不穩定。在實際應用中,酶反應溫度的確定應兼顧最適溫度和熱穩定性,可在略低于最適溫度范圍內選擇。

圖3 溫度對LacA和LacB活性的影響Fig.3 Effect of temperature on laccase A and laccase B acdvity

圖4 溫度對LacA和LacB的穩定性影響Fig.4 Effectof temperature on laccase A and laccase B stabilities

2.4 最適反應pH及pH穩定性

不同pH值下LacA、LacB的酶活測定(圖5)結果表明,LacA在pH 4.5時表現最大酶活力,LacB在pH 4.0表現最大酶活力,在pH 3.5～5.0 LacA和LacB相對酶活都高于70%,pH高于6.5時表現酶活最小。圖6結果表明,LacA在pH 2.2～4.5比較穩定,殘余酶活低保持在70%以上,LacB在pH 2.2～5.0也比較穩定,殘余酶活在60%以上。LacA和LacB在pH高于6.5時酶活損失都比較嚴重,由此表明LacA和LacB都是耐酸性酶。

圖5 pH值對LacA和LacB的影響Fig.5 Effect of pH on laccase A and laccase B activity

圖6 pH值對LacA和LacB穩定性的影響Fig.6 Effect of pH on laccase A and laccase B stabilities

2.5 無機離子對酶活性的影響

從圖7的試驗結果可以看出,Cu2+、Mg2+對LacA有激活作用,對LacB影響不大;Ag+對兩同工酶表現為完全抑制;Fe3+對LacA和LacB有一定的抑制作用;Ca2+、Mn2+、K+、Na+、Zn2+對LacA和LacB影響不大。

2.6 抑制劑對酶活性的影響

從表1的試驗結果可以看出,抑制劑DTT、EDTA、DMSO、SDS對酶均有不同程度的抑制作用。DTT對漆酶表現為完全抑制;EDTA在較高濃度時對LacA、LacB有抑制;DMSO、SDS隨濃度的增加,抑制作用也逐漸增強。

圖7 無機離子對LacA和LacB酶活性的影響Fig.7 Effect ofmetal ions on activity ofLacA and LacB

表1 抑制劑對LacA和LacB的影響Table 1 Effect of Inhibitor on activity ofLacA and LacB

3 結 論

本文對毛栓菌所產漆酶的分離純化及部分酶學性質進行了研究。通過80%硫酸銨鹽析、濃縮、透析、DEAE sepharose Fast Flow柱層析、NaCl線性梯度洗脫后,得到2個漆酶同工酶活力峰,分別合并收集并命名為LacA、LacB,然后進行SDSPAGE電泳分析,結果看到蛋白帶有多條,漆酶帶有2條,可以斷定該菌株漆酶含有2型漆酶的組分,測得2種漆酶同工酶的分子量分別為54.6、17.7 ku。

對漆酶LacA、LacB的部分酶學性質進行了研究。LacA和LacB最適反應溫度分別為50、60℃,在30～70℃范圍內其酶活受溫度影響較大,在40℃以下均具有較好的熱穩定性,但高于60℃很不穩定;LacA、LacB反應最適pH分別為4.5、4.0,LacA在pH 2.2～4.5,LacB在pH值3.5～5.0,表現較好的穩定性;Cu2+、Mg2+對LacA有激活作用,對LacB影響不大,Ag+對LacA和LacB表現為完全抑制;Fe3+對LacA和LacB有一定的抑制作用;Ca2+、Mn2+、K+、Na+、Zn2+對LacA和LacB影響不大。DTT、EDTA、DMSO、SDS對酶均有不同程度的抑制作用,且隨其濃度的升高抑制作用增強。

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