適應(yīng)水稻秸稈還田的抗稻紋枯病拮抗菌株的篩選

宋僅星， 于士軍， 蔣 嵐， 樊美珍， 朱 虹

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036）

稻草是重要的有機(jī)肥源，稻草還田可減少化肥用量，降低農(nóng)業(yè)成本，提高水稻品質(zhì)，具有重要的生產(chǎn)和生態(tài)效益。將稻草機(jī)械化粉碎直接還田，是目前我國(guó)國(guó)務(wù)院、農(nóng)業(yè)部和發(fā)改委大力推廣的秸稈綜合利用方式之一［1－2］。已有報(bào)道秸稈還田有利于減少水稻紋枯病的發(fā)生，主要原因是秸稈腐解后提高了土壤有機(jī)質(zhì)的含量［3］，然而，秸稈在自然狀態(tài)下腐解較慢，對(duì)后茬作物的生長(zhǎng)不利，因此，如何促進(jìn)水稻秸稈還田后快速腐解已成為亟待解決的重要問題。

水稻紋枯病是我國(guó)稻區(qū)三大病害之一，目前，主要采用化學(xué)防治控制該病，但成本高、污染環(huán)境，容易造成農(nóng)藥殘留問題，而且長(zhǎng)期使用容易產(chǎn)生抗藥性。因此，利用微生物的拮抗作用來防治水稻紋枯病是近年來研究的熱點(diǎn)。芽胞桿菌（Bacill us spp．）和木霉（Trichoder ma spp．）能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，在植物病害生物防治中被廣泛應(yīng)用，它們應(yīng)用于水稻紋枯病防治已有較多報(bào)道［4－9］，同時(shí)芽胞桿菌和木霉也能產(chǎn)生纖維素酶來分解纖維素［10－12］，對(duì)稻草秸稈有較強(qiáng)的降解能力。因此，本研究通過從自然界篩選對(duì)水稻秸稈有較強(qiáng)適應(yīng)性和分解能力同時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌又有一定拮抗作用的芽胞桿菌和木霉，然后將這些菌株返回到土壤中，對(duì)水稻秸稈還田后能快速腐解同時(shí)又能減輕水稻紋枯病的發(fā)生具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 樣品

從水稻田里不同地點(diǎn)分別取土樣。

1．1．2 菌株來源

水稻紋枯病菌（Rhizoctonia sol ani）本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株，木霉T1、T3和T4分離自安徽省牯牛降土壤，木霉T2、T7和T9分離自安徽省天堂寨土壤，木霉T5、T6和T8分離自安徽省霍山縣土壤。

1．1．3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，p H 自然。

PCS培養(yǎng)基：0．50% 蛋白胨，0．50%Na Cl，0．30%Ca CO3，0．10%酵母粉，p H7．0左右，1%的水稻秸稈作為唯一碳源。

稻草固體培養(yǎng)基：稻草粉70%，麥麩30%，含水率70%，無機(jī)鹽溶液（（NH4）2SO46 g，Ca Cl20．1 g，Mg SO4·7 H2O5 g，KH2PO41 g，Na Cl 0．1 g，F(xiàn)e－SO4·7 H2O 0．05 g，MnSO4·7 H2O 0．016 g，Zn－SO4·7 H2O 0．014 g）

1．2 方法

1．2．1 菌株的分離

1．2．1．1 芽胞桿菌的分離

參照張曉舟等［13］的方法。每份土樣稱取10 g，放入盛有90 mL無菌水的三角瓶中，在搖床上劇烈振蕩30 min后于90℃的水浴中保持20 min。然后用無菌水進(jìn)行梯度稀釋后涂布PDA平板，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h左右，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落進(jìn)行鑒定。

1．2．1．2 芽胞桿菌的鑒定

［14－15］對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，將鑒定為芽胞桿菌的菌株進(jìn)行初篩。

1．2．2 降解水稻秸稈菌株的篩選

1．2．2．1 降解水稻秸稈芽胞桿菌的篩選

參照張承胤等［16］的方法，在100 mL三角瓶?jī)?nèi)分別裝80 mL PCS培養(yǎng)基，將初篩的芽胞桿菌做成菌懸液后，按5%的量接種到培養(yǎng)基中15 d后將降解剩余物經(jīng)5 000 r／min離心10 min后，棄去上清液，并用8%甲酸溶液10 mL處理降解剩余物，經(jīng)定性濾紙過濾，過濾時(shí)用蒸餾水分?jǐn)?shù)次沖洗，將濾紙置于60℃下烘干至恒重［17］，然后測(cè)纖維素含量、半纖維素含量、木質(zhì)素含量及其降解率。

1．2．2．2 降解水稻秸稈木霉的篩選

在每個(gè)250 mL的三角瓶中加入10 g稻草固體培養(yǎng)基，121．5℃滅菌45 min，取拮抗木霉菌株斜面各1管，在無菌操作條件下，分別將一定量的孢子刮到滅過菌的吐溫80中，制備成孢懸液，然后取孢懸液于血球計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)，觀察計(jì)算得每毫升數(shù)量級(jí)為106個(gè)孢子。然后將孢懸液接到固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，以接入無菌水為對(duì)照，重復(fù)3次，分別在第0天和第15天測(cè)量發(fā)酵體系中的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量并計(jì)算它們的降解率。

1．2．3 降解菌對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果測(cè)定

1．2．3．1 芽胞桿菌對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果

1）平板對(duì)峙培養(yǎng) 采用PDA平板對(duì)峙生長(zhǎng)法［18］將較好的秸稈降解菌株點(diǎn)接在距平板中央3 c m處的4個(gè)點(diǎn)上，同時(shí)平板中央移入一直徑5 mm的稻紋枯病菌的瓊脂塊，置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以不接芽胞桿菌菌株作為對(duì)照，每處理4次重復(fù)。3 d后測(cè)紋枯病菌落指向芽胞桿菌的半徑以及對(duì)照組的半徑并計(jì)算篩選菌株對(duì)紋枯病菌的抑菌率。2）芽胞桿菌代謝物對(duì)紋枯病菌的抑制作用 將秸稈降解菌株接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)48 h，然后將發(fā)酵液高速離心，取上清液，經(jīng)細(xì)菌過濾器（d＝0．2μm）過濾，得到該菌的發(fā)酵培養(yǎng)液，用PDA培養(yǎng)基把發(fā)酵液分別稀釋2、10、20、40倍和100倍，然后倒平板，在平板中央接紋枯病菌菌塊，25℃培養(yǎng)，分別于1、3 d和6 d測(cè)定菌落直徑，計(jì)算對(duì)紋枯病菌的抑制率，同時(shí)觀察記載菌核出現(xiàn)的時(shí)間，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1．2．3．2 木霉對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果

1）采用PDA平板對(duì)峙生長(zhǎng)法［18］：設(shè)只接種紋枯病菌為對(duì)照，每處理4個(gè)重復(fù)，25℃恒溫培養(yǎng)。接種3 d后測(cè)量?jī)山臃N點(diǎn)連線上紋枯病菌的菌落半徑，以對(duì)照為基礎(chǔ)，計(jì)算對(duì)紋枯病的抑制率，觀察木霉是否覆蓋紋枯病菌菌落。2）木霉代謝物對(duì)紋枯病菌的抑制作用：將木霉在25℃下培養(yǎng)4 d后以同等質(zhì)量接種在覆蓋有玻璃紙的PDA平板上，以覆蓋玻璃紙但不接菌的平板作為對(duì)照，25℃下培養(yǎng)2 d，然后將長(zhǎng)有木霉菌絲的玻璃紙去掉，同時(shí)去掉對(duì)照的玻璃紙，將培養(yǎng)2 d后的紋枯病菌以同等質(zhì)量接到含有木霉代謝物以及對(duì)照的平板上，觀察不同時(shí)間紋枯病菌及菌核的生長(zhǎng)情況并計(jì)算木霉對(duì)紋枯病菌的抑制率。

1．2．4 降解菌對(duì)水稻秸稈的適應(yīng)性測(cè)定

1．2．4．1 芽胞桿菌對(duì)水稻秸稈適應(yīng)性測(cè)定

將芽胞桿菌做成菌懸液后，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定芽胞桿菌的數(shù)量，按5%的量接種到PCS培養(yǎng)基中，分別在3、5、7、9 d和15 d用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定培養(yǎng)基中芽胞桿菌的數(shù)量，然后計(jì)算芽胞桿菌的增殖率。

1．2．4．2 木霉對(duì)水稻秸稈的適應(yīng)性測(cè)定

將木霉制成孢懸液后，接到稻草固體發(fā)酵培養(yǎng)基上，以接入無菌水作為對(duì)照，重復(fù)3次，接種后每天觀察各菌株的產(chǎn)孢情況。

2 結(jié)果與分析

2．1 芽胞桿菌的分離與鑒定

從水稻田分離了4株菌株，根據(jù)菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征對(duì)其進(jìn)行初步鑒定結(jié)果見表1。

表1 4株菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征

2．2 13株菌株對(duì)水稻秸稈的降解效果

13株菌株對(duì)稻草的腐解效果如表2所示，在發(fā)酵15 d后，水稻秸稈的不溶性碳源均有不同程度的降低，從表3可以看出4株芽胞桿菌中B4較好，15 d發(fā)酵結(jié)束后纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解率分別為1．01%、1．53%和0．41%；從表2可以看出9株木霉中T3、T5、T6和T9對(duì)水稻秸稈的降解效果較好，其中T5和T9的降解效果最好。

表2 不同菌株培養(yǎng)前后秸稈中不溶性碳源的含量 %

2．3 降解菌對(duì)水稻紋枯病菌的抑制效果

2．3．1 對(duì)峙培養(yǎng)結(jié)果

將對(duì)稻草秸稈降解較好的菌株和水稻紋枯病菌進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果如表4所示，所有的菌株對(duì)紋枯病菌都有不同程度的抑制作用，B4菌株對(duì)紋枯病菌的抑菌率為40．48%，而且在對(duì)峙培養(yǎng)過程中，抑菌帶能長(zhǎng)久地保持，在4株木霉中，T9對(duì)稻紋枯病菌的抑制作用最強(qiáng)，其次是T6、T3和T5，3 d后的抑制率分別為50．99%、46．48%和45．63%，對(duì)峙培養(yǎng)7 d后，木霉T9、T6、T5和T3占據(jù)了整個(gè)平板，并產(chǎn)生了大量的綠色孢子，且與對(duì)照相比產(chǎn)生菌核數(shù)較少。

表3 不同處理秸稈中不溶性碳源的降解率1） %

表4 芽胞桿菌和木霉對(duì)紋枯病菌的拮抗效果1）

2．3．2 降解菌代謝物對(duì)紋枯病菌的抑制作用

芽胞桿菌B4和木霉T9、T6、T5和T3的代謝物對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用結(jié)果見表5和表6。表5表明，B4菌株培養(yǎng)液稀釋2倍到稀釋100倍對(duì)紋枯病菌的生長(zhǎng)都有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越強(qiáng)。稀釋2倍和10倍的培養(yǎng)液對(duì)紋枯病菌的抑制作用最強(qiáng)，在第6天時(shí)抑菌率仍然保持100%，其余稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)液對(duì)紋枯病菌的抑制率隨時(shí)間推移逐漸下降，其中紋枯病菌在含有稀釋40倍和稀釋100倍培養(yǎng)液的PDA平板上分別在第4天和第3天長(zhǎng)滿平板，但是第6天時(shí)仍然沒有產(chǎn)生菌核，在隨后的幾天觀察中仍然沒有菌核產(chǎn)生，而對(duì)照組在第3天即產(chǎn)生菌核。從表5可以看出，這4株木霉的代謝物對(duì)水稻紋枯病菌有較好的抑制作用，第6天時(shí)對(duì)紋枯病菌的抑制率仍然為100%，而對(duì)照組中紋枯病菌在第3天長(zhǎng)滿平板并產(chǎn)生大量菌核，由此見得芽胞桿菌B4和這4株木霉的代謝物能抑制菌絲的生長(zhǎng)和阻止菌核的形成。

2．4 降解菌對(duì)水稻秸稈的適應(yīng)能力測(cè)定結(jié)果

5株對(duì)水稻秸稈有較強(qiáng)降解能力同時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌又有抑制作用的菌株對(duì)水稻秸稈的適應(yīng)能力測(cè)定結(jié)果如表7和表8所示，在15 d的發(fā)酵周期結(jié)束后，芽胞桿菌的增殖率為163．77%，可見其對(duì)水稻秸稈有一定的適應(yīng)能力。4株拮抗木霉都能在稻草固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢，其中木霉T9產(chǎn)孢能力最強(qiáng)，說明它對(duì)稻草的適應(yīng)和利用能力最強(qiáng)。

表5 B4菌株代謝物對(duì)紋枯病菌的抑制效果1）

表6 木霉T3、T5、T6和T9代謝物對(duì)紋枯病菌的抑制效果1）

表7 芽胞桿菌B4對(duì)水稻秸稈的適應(yīng)性測(cè)定結(jié)果

表8 木霉T3、T5、T6和T9對(duì)水稻秸稈的適應(yīng)性測(cè)定結(jié)果1）

3 討論

水稻秸稈還田后在土壤中微生物的作用下快速腐解增加了土壤中有機(jī)質(zhì)的含量，從而提高了水稻的抗病能力［3］，同時(shí)水稻秸稈腐解后能產(chǎn)生一些對(duì)植物病原菌有抑制作用的酚酸類物質(zhì)［19］，因此本試驗(yàn)從土壤中篩選了對(duì)水稻秸稈有較好降解能力的芽胞桿菌B4和木霉T3、T5、T6和T9菌株，然后將這5株菌株配合其他腐桿劑返回到水稻田里來加速秸稈的腐解，對(duì)于秸稈腐解后的產(chǎn)物對(duì)水稻紋枯病菌是否有抑制作用將進(jìn)一步研究。這5株菌株對(duì)水稻紋枯病菌有一定的拮抗作用，在對(duì)峙培養(yǎng)中，3 d時(shí)木霉T9對(duì)水稻紋枯病菌抑制率為53．38%。唐家斌［4］等報(bào)道的拮抗菌的抑制效果為52．54%，而且它們的代謝物能抑制菌絲的生長(zhǎng)和菌核的形成，陳志誼等［8］對(duì)拮抗細(xì)菌B－916的拮抗物質(zhì)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的拮抗素對(duì)紋枯病菌的抑制起主要作用。

目前篩選了利用芽胞桿菌屬（Bacill us）A30［20］、木霉屬（Trichoder ma）等對(duì)紋枯病菌有抑制作用的菌株，這些菌株可應(yīng)用于水稻紋枯病的生物防治，王艷麗［6］等用哈茨木霉TC3和NF9進(jìn)行水稻紋枯病的防治研究，發(fā)現(xiàn)防效可以達(dá)到62．48%～72．29%。同時(shí)也篩選了能夠降解纖維素的芽胞桿菌和木霉［10－12］。然而，有關(guān)這些菌株降解秸稈、對(duì)秸稈的適應(yīng)性以及它們抗水稻紋枯病菌的綜合能力未見報(bào)道。本試驗(yàn)對(duì)篩選獲得的5株具有降解水稻秸稈能力的菌株進(jìn)行了對(duì)水稻紋枯病抑制效果的測(cè)定及對(duì)水稻秸稈適應(yīng)能力的研究，結(jié)果表明木霉T5和T9具有降解秸稈和抑制稻紋枯病菌的雙重效果。

參考文獻(xiàn)

［1］ 國(guó)家發(fā)展改革委，農(nóng)業(yè)部．關(guān)于編制秸稈綜合利用規(guī)劃的指導(dǎo)意見［R］．發(fā)改環(huán)資［2009］378．

［2］ 國(guó)務(wù)院辦公廳．關(guān)于加快推進(jìn)農(nóng)作物秸稈綜合利用的意見［R］．國(guó)辦發(fā)［2008］105號(hào)．

［3］ 張小燕，鄧欽陽(yáng)，李冬霞，等．水稻秸稈還田方式對(duì)稻紋枯病發(fā)生的影響［J］．廣西植保，2008，21（3）：11－13．

［4］ 唐家斌，馬炳田，王玲霞，等．用木霉、類木霉對(duì)水稻紋枯病進(jìn)行生物防治的研究［J］．中國(guó)水稻科學(xué)，2002，16（1）：63－66．

［5］ 孫冬梅，林志偉．黃綠木霉發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌作用的研究［J］．植物保護(hù)，2009，35（4）：83－86．

［6］ 王艷麗，沈 瑛．哈茨木霉防治水稻紋枯病研究［J］．植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2000，27（2）：97－101．

［7］ 陳志誼，高太東，嚴(yán)大富，等．枯草芽胞桿菌B－916防治水稻紋枯病的田間試驗(yàn)［J］．中國(guó)生物防治，1997，13（2）：75－78．

［8］ 陳志誼，許志剛，陸 凡，等．拮抗細(xì)菌B－916培養(yǎng)液對(duì)水稻紋枯病菌的抗生活性及其抗菌物質(zhì)的研究［J］．江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，16（3）：148－152．

［9］ 黎起秦，林緯，陳永寧，等．芽胞桿菌對(duì)水稻紋枯病的防治效果［J］．中國(guó)生物防治，2000，16（4）：160－162．

［10］燕紅，楊謙．蠟樣芽胞桿菌對(duì)稻草的降解作用［J］．哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，40（8）：1242－1246．

［11］張德強(qiáng)，黃鎮(zhèn)亞，張志毅．綠色木霉AS3．3032纖維素酶固態(tài)發(fā)酵研究［J］．北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23（2）：57－60．

［12］靖德兵，李培軍，郭偉，等．康氏木霉產(chǎn)酶發(fā)酵固體培養(yǎng)基優(yōu)化研究［J］．蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，40（3）：66－70．

［13］張曉舟，徐劍宏，李順鵬．植病生防芽胞桿菌的分離篩選與初步鑒定［J］．土壤，2005，37（1）：85－88．

［14］Buchanan（布坎南）RE，Gibbons（吉本斯）NE．伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］．第8版．北京：科學(xué)出版社，1984．

［15］東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］．北京：科學(xué)出版社，2001．

［16］張承胤，邢彥峰，代麗，等．適應(yīng)玉米秸稈還田的小麥根病拮抗細(xì)菌的篩選［J］．中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（3）：206－209．

［17］韓如旸，陳美慈，閔航，等．嗜熱厭氧細(xì)菌Clostridiu m sp．EVA4菌株直接轉(zhuǎn)化纖維素產(chǎn)乙醇的研究［J］．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1999，5（S1）：170－174．

［18］紀(jì)明山，王英姿，程根武，等．西瓜枯萎病拮抗菌株篩選及田間防效試驗(yàn)［J］．中國(guó)生物防治，2002，18（2）：71－74．

［19］朱林，張春蘭，沈其榮，等．稻草等有機(jī)物料腐解過程中酚酸類化合物的動(dòng)態(tài)變化［J］．土壤學(xué)報(bào)，2001，38（4）：471－475．

［20］陳衛(wèi)良，龔鴻，林福呈，等．拮抗細(xì)菌Bacill us subtilis A30對(duì)水稻病原菌的抑制作用［J］．浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，23（6）：649－654．