廣西防城港首次截獲苜蓿黃萎病菌

黃勝光， 盧兆山， 邱世明， 奚國華， 陸 道， 鐘恒祿

（廣西防城港出入境檢驗檢疫局，538001）

廣西防城港首次截獲苜蓿黃萎病菌

黃勝光， 盧兆山， 邱世明， 奚國華， 陸 道， 鐘恒祿

（廣西防城港出入境檢驗檢疫局，538001）

從一批進境的美國苜蓿草樣品中保濕分離得到了3株與苜蓿黃萎病菌（Verticillium albo-atrum）相似的目標菌VA1、VA2、VA3。該目標菌在PDA上生長迅速，菌絲生長0.8～1.0mm／d，2～3d即可生成肉眼可見的菌落斑點；菌落為白色圓形，邊緣規則呈圓形，菌絲較致密，氣生菌絲較少，菌落中心乳白色奶凍狀；培養4～5d即后產生氣生典型輪枝狀分生孢子梗，7～8d后菌落中央表面因產生休眠菌絲開始變成黑褐色至黑色，20d后菌落的表面和背面大部分均變黑色，仍不產生微菌核和厚垣孢子。該目標菌的純培養用V.albo-atrum特異引物Vaa1／Vaa2進行檢測，PCR擴增后得到預期330bp的產物片段，產物序列與V.albo-atrum相應序列的相似性為100%。從而鑒定確認該目標菌為苜蓿黃萎病菌V.albo-atrum。

苜蓿黃萎病菌； 檢疫； 口岸截獲

致 謝： 目標菌純培養送至江蘇出入境檢驗檢疫局，由吳翠萍、李彬復核確認，特此致謝。

聯系方式 Tel：0770-2822708；E-mail：gxhsg＠163.com

輪枝菌的2個最重要植物寄生菌就是苜蓿黃萎病菌（Verticillium albo-atrum）和棉花黃萎病菌（V dahliaeKlebahn）［1］。其中苜蓿黃萎病菌危害大、致病力強是我國檢疫性真菌病害。此病最早于1918年發現于瑞典Hedlund，1923年－1950年基本遍布整個北歐［2］，1977年美國第一次報道發現苜蓿黃萎病菌［3］，從此此病在美國快速擴展，成為許多地方苜蓿種植的一個重要限制因素［4－5］。

2010年10月下旬，防城港檢驗檢疫局受理報檢了一批從美國進口的苜蓿草，該批貨物共5個集裝箱，重量118.6t，貨值3.38萬美元。檢驗檢疫人員對該批貨物實施了現場查驗、抽樣。樣品經實驗室保濕培養，發現疑似苜蓿黃萎病菌，分離純化后獲得的純培養，觀察和測量其形態特征，同時通過PCR檢測以及PCR擴增產物經測序與基因庫比對分析，確認該批貨物含有我國禁止進境植物檢疫性有害生物——苜蓿黃萎病菌（V.albo-atrum）。發現疫情后，該局根據相關規定及時出具了《檢驗檢疫處理通知書》，對該批貨物已作監督退運處理。現將檢疫鑒定結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

美國進境紫花苜蓿干草樣品，試驗樣品重量為5袋計5kg，陽性對照為V.albo-atrumM1菌株（由江蘇出入境檢驗檢疫局吳翠萍女士提供）。

1.2 樣品保濕培養

盡可能地挑取枯黃的莖稈以及維管束褐變的莖稈樣品，每根莖稈剪取一段，約長4cm，共剪取100根，加入1%次氯酸鈉溶液，消毒1min，取出用無菌水漂洗3～4次，分別均勻擺放到15套滅菌9cm培養皿中，置于24℃黑暗條件下保濕培養。

1.3 疑似目標菌的觀察

保濕培養7d后在體視鏡下逐根觀察苜蓿草莖稈段，觀察有無典型輪生樹枝狀分生孢子梗產生。

1.4 目標菌的形態學鑒定

用接種針沾下分生孢子梗頂端的孢子團，在含青霉素的培養基上畫線分離培養，進一步進行單孢分離而獲得純培養。觀察單孢分離培養后菌落生長的形態、菌絲特征，以及分生孢子梗和分生孢子，有無休眠菌絲、厚垣孢子、微菌核產生等情況。

1.5 目標菌純培養的PCR檢測

取疑似目標菌絲純化后液氮研磨提取DNA，取1μL為模板。試驗采用V.albo-atrum特異性引物Vaa1： 5′-CCGGTACATCAGTCTCTTTA-3′ 和Vaa2：5′-CTCCGATGCGAGCTGTAAT-3′ 進 行PCR檢測［6］，預期擴增產物為330bp，引物委托上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反應體系為：premix 15μL，10μmol／L、下游引物Vaa01／Vaa2各1μL，模板DNA 1μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，以滅菌超純水補足總體積至30μL。陽性對照模板為菌株M1的DNA，陰性對照模板為超純水。反應程序為：94℃變性5min；進入循環，95℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；最后72℃延伸10min。

取20μL擴增產物于1.5%的瓊脂糖凝膠1×TAE緩沖液中進行電泳，GEL RED染色后用凝膠成像系統分析。

2 結果

2.1 目標菌的發現

在體視鏡下觀察所有100根苜蓿草莖稈段，發現其中3根有典型輪生樹枝狀的分生孢子梗產生，分生孢子梗直立，梗上每節輪生2～4個小梗，在小梗頂端產生分生孢子團（圖1a）。

圖1 苜蓿黃萎病菌的形態鑒定

2.2 目標菌形態學的觀察與測量

用接種針在苜蓿草段的分生孢子梗頂端的孢子團沾一下，分別在含青霉素的PDA上畫線分離，約培養20h分生孢子即開始萌發，用接種鏟挑取萌發的單孢進行培養而獲得純培養。對這3根苜蓿草段上分生孢子分離而獲得的純培養分別編號為VA1、VA2、VA3。

目標菌在PDA上生長迅速，菌絲生長0.8～1.0mm／d，2～3d即可生成肉眼可見的菌落斑點。菌落邊緣規則呈圓形或近圓形，菌絲較致密，氣生菌絲較少，菌落中心乳白色奶凍狀（圖1b）。初期主要產生生長于培養基下的營養菌絲，4～5d后產生典型的氣生輪枝狀分生孢子梗，可見二次分枝，有隔、無色至淡色，梗上每節輪生2～4個小梗，小梗大小為（21～45）（～64）μm×（1.5～3.5）μm，平均大小為33.14μm×2.18μm。分生孢子橢圓形、圓筒形，無色，單孢，少數孢子1隔，大小為（2.5～12.5）（～16）μm×（2～4.5）μm，平均大小為6.88μm×3.22μm（圖1c）。培養7～8d后菌落中央因產生休眠菌絲開始變成黑褐色，休眠菌絲黑暗褐色至黑色（圖1d），直徑3～9μm，分隔規則，隔膜間膨大，胞壁增厚，呈念珠狀，有時集結成菌絲結或瘤狀菌絲體，培養20d不產生厚垣孢子和微菌核。據此，該目標菌的形態特征基本與有關標準描述的苜蓿黃萎病菌相吻合［7］。

2.3 PCR檢測結果

對分離得到的目標菌株純培養用V.albo-atrum的特異性引物Vaa1／Vaa2進行PCR擴增，結果表明，3個菌株均呈PCR陽性。

圖2 目標菌株純培養PCR檢測電泳圖

2.4 PCR擴增產物經測序與基因庫比對分析

測序所得333bp長序列，經GenBank（NCBI）Blast分析（表1）表明，序列和X60705、GU291258、GQ495790、GQ336791等17個菌株登記序列100%相同，與Z29510、Z29509、GQ495792等33條序列有3個堿基的差異。

表1 菌株測序所得序列與GenBank（NCBI）已有苜蓿黃萎病菌序列Blast比對表

綜上所述，鑒定該批苜蓿草帶有我國禁止進境的檢疫性病菌——苜蓿黃萎病菌（V.albo-atrumReinke et Berthold）。這是防城港檢驗檢疫局首次截獲該菌。

3 討論

近年來，我國從美國進口苜蓿草呈大幅增長的趨勢，2007年不足1萬t，2009年為7.6萬t，而2010年高達22.72萬t。苜蓿黃萎病菌是我國重要的進境檢疫性病菌，不僅對苜蓿草造成危害，還會對啤酒花、蛇麻草、花生和馬鈴薯等多種園藝作物及經濟作物造成嚴重危害［8］；該病菌可通過昆蟲、水流、風、收割機械、花粉等近距離傳播［9－13］，通過干草、種子、塊莖及病殘體等進行遠距離傳播［14］，因此來自苜蓿黃萎病發生區的苜蓿飼草傳帶苜蓿黃萎病的風險很高。同時我國當前苜蓿生產主栽品種多為感病品種，該病菌在我國的適生性強，特別在我國西北、東北以及華北地區的苜蓿種植區適生程度處于較高水平［15］。一旦苜蓿黃萎病傳入定殖蔓延，對苜蓿生產將造成毀滅性打擊。因此，各口岸必須加強檢疫，嚴防該病的傳入與傳播。

本試驗培養的苜蓿黃萎病菌形態學上與其相似的輪枝孢屬近似種V.dahliae、V.nigrescens、V.nubilum和V.tricorpus相比，在分生孢子梗長度、輪生小梗數目、小梗和分生孢子的大小之間有差別也有交疊［16－20］，但 由 于V.dahliae在 PDA 上 培 養 10～14d后產生黑色微菌核，V.nigrescens產生黑褐色厚垣孢子，V.nubilum亦生黑褐色厚垣孢子，V.tricorpus產生休眠菌絲、微菌核和厚垣孢子［21］，而苜蓿黃萎病菌只產生休眠菌絲不產生微菌核和厚垣孢子；同時本試驗還通過設計特異性引物對該菌進行PCR檢測，因而較容易將苜蓿黃萎病菌與這幾個近似種區別開來。

本試驗采用莖稈保濕培養法，可直接在體視鏡下觀察到疑似目標菌分生孢子梗和分生孢子團，實踐中作者嘗試過直接用挑針沾取這些分生孢子團進行PCR檢測，效果很好。實際工作中可以將目標菌分離純化和PCR檢測同步進行，以便進一步縮短檢測時間。

本試驗從樣品保濕培養7～9d、目標菌分離純化4～5d、PCR檢測2～3d、直到最后結果確認所需時間在13～17d，而目前行業標準《苜蓿黃萎病檢疫鑒定方法》SN／T 1145—2002中保濕培養需20d、還有分離純化、致病性檢測等，這樣時間會拉得很長，遠不能適應當今國際貿易的需求。建議國家質檢總局盡快組織專家對該行業標準進行修訂。

［1］ Isaac I.Speciation inVerticillium［J］.Annual Review of Phytopathology，1967，5：201-222.

［2］ Krietlow K W.Verticilliumwilt of alfalfa－a destructive disease in Britain and Europe not yet observed in the United States［R］.USDA Agric Res Service ARS 34-20，1962：1-15.

［3］ Graham J H，Peaden R N，Evans D W.Verticilliumwilt of alfalfa found in the United States［J］.Plant Dis Rep，1977，61：337-340.

［4］ Arny D C，Grau C，R.Importance ofVerticilliumwilt of alfalfa in North America［J］.Can J Plant Pathol，1985，7：187-190.

［5］ Heale J B.Verticilliumwilt of alfalfa，background and current research［J］.Can J Plant Pathol，1985，7：191-198.

［6］ Zhang Z G，Chen R H，Wang Y C.Molecular detection ofVerticillium albo-atrumby PCR based on ITS sequences［J］.Agricultural Sciences in China，2005，4（10）：760-766.

［7］ 章桂明，王穎，王伍，等.SN／T 1145-2002，植物檢疫 苜蓿黃萎病菌檢疫鑒定方法［S］.中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準.中國標準出版社，2002：1-6

［8］ Larsen R C，Vandemark G J，Hughes T J，et al.Development of real-time polymerase chain reaction assay for quantifyingVerticillium albo-atrumDNA in resistant and susceptible alfalfa［J］.Phytopathology，2007，97（11）：1519-1525.

［9］ Huang H C，Harper A M，Kokko E G，et al.Aphid transmission ofVerticillium albo-atrumto alfalfa［J］.Can J of Plant Pathol，1983，5（3）：141-147.

［10］Huang H C，Richards K W，Kokko E G，et al.Role of the leafcutter bee in dissemination ofVerticillium albo-atrumin alfalfa［J］.Phytopathology，1986，76（1）：75-80.

［11］Howard R J.Local and long distance spread ofVerticilliumspecies causing wilt of alfalfa［J］.Can J Plant Pathol，1985，7：199-202.

［12］Huang H C，Hanna M R，Kokko E G.Mechanisms of seed contamination byVerticillium albo-atrumin alfalfa［J］.Phytopathology，1985，75：482-488.

［13］Isaac I.Wilt of lucerne caused by species ofVerticillium［J］.Ann Appl Biol，1957，45：550-558.

［14］CAB International.Crop Protection Compendium 2007Edition［M］.Wallingford，UK：CAB International，2007.

［15］王春林，吳立峰，王雪薇，等.加拿大、美國苜蓿黃萎病菌發生控制情況及我國對策［J］.植物檢疫，2003，17（1）：57-59.

［16］Hawksworth D L，Talboys P W.Verticillium albo-atrum［M］∥CMI Description of Pathogenic Fungi and Bacteria，No.255.Wallingford，UK：CABI Publishing，1970.

［17］Hawksworth D L，Talboys P W.Verticillium dahliae［M］∥CMI Description of pathogenic fungi and Bacteria，No.256.Wallingford，UK：CABI Publishing，1970.

［18］Hawksworth D L.Verticillium nigrescens［M］∥ CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria，No.257.Wallingford，UK：CABI Publishing，1970.

［19］Hawksworth D L.Verticillium nubilum［M］∥ CMI Descriptions of Pathogenic Fungi and Bacteria，NO.268.Wallingford，UK：CABI Publishing，1970.

［20］Hawksworth D L.Verticillium tricorpus［M］∥ CMI Description of Pathogenic Fungi and Bacteria，No.260.Wallingford，UK：CABI Publishing，1970.

［21］商鴻生，楊家榮，趙小明.苜蓿黃萎病菌與輪枝孢屬近似種的比較研究［J］.草業學報，1996，7（4）：32-36.

First interception ofVerticillium albo-atrumin Fangchenggang of Guangxi

Huang Shengguang， Lu Zhaoshan， Qiu Shiming， Xi Guohua， Lu Dao， Zhong Henglu
（Fangchenggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangxi538001，China）

Three strains of the fungus，namely VA1，VA2 and VA3，were isolated from a batch of alfalfa samples，which were imported from USA and incubated under moist conditions，demonstrating the characters similar toV.albo-atrum.The strains grew rapidly on the PDA，with the colony growing at 0.8-1.0mm／d.After 2-3 days，the spot colony could be seen on the PDA.In addition，the colony had a regular and rounded margin with white compact mycelium and fewer aerial mycelia.The target fungus produced typical round aerial branched conidiophores after 4-5 days，and then became dark brown to black along with production of resting hyphae at the centre of the colony after 7-8 days，and the color of the surface and most of the back of the colony changed to black 20 days later，but still could not produce micro-sclerotia and chlamydospores.The pure cultures of the target germ were detected by the specific primers Vaa1／Vaa2.As expected，a330 bp fragment was obtained by PCR amplification.The similarity between the product and corresponding sequence inV.albo-atrumwas 100%.Therefore，it was confirmed that the target germ wasV.albo-atrum.

Verticillium albo-atrum； inspection； interception at port

S 435.4

B

10.3969／j.issn.0529-1542.2012.01.040

2011-04-29

2011-05-15