黃皮素內酯Ⅱ在黃皮植物體的分布及對稗草生化代謝的影響

盧海博， 萬樹青

（1.農藥與化學生物學教育部重點實驗室，華南農業大學昆蟲毒理研究室，廣州 510642；2.河北北方學院農林科技學院，張家口 075131）

隨著生產力水平的提高，我國除草劑發展迅速，但大部分除草劑是化學合成藥劑，施用以后由于化學殘留問題經常對下茬作物造成藥害，所以開發高效、低毒、對環境安全的除草劑就非常重要。從植物中尋找具有農藥活性的化合物，是開發環境和諧農藥的一條重要途徑［1－5]。眾所周知，以天然除蟲菊和煙堿為先導化學物，人工合成開發出現代擬除蟲菊酯類和新煙堿類殺蟲劑并已取得廣泛的應用就是一個很好的例子。

黃皮為蕓香科（Rutaceae）黃皮屬（Clausena）植物。本屬植物全世界約有30種，分布于熱帶、亞熱帶地區，我國有近10種，分布于長江以南各省，以云南南部、廣東、廣西、海南及臺灣等省分布較為集中，資源豐富。黃皮為南方特有的水果并兼有藥用價值，具有保肝降脂、解痙、抑菌及抗癌等生物活性［6－7]。除藥用外，人們也在農業應用方面展開了一系列的研究，徐漢虹［8]等發現齒葉黃皮（Clausena dunniana Lévl.）精油具有殺蟲作用并分離得到其殺蟲主要成分為愛草腦。萬樹青［9－10]等發現，黃皮［C.lansium（Lour.）Skeels]果核甲醇提取物對農田主要雜草具有抑制生長活性。對黃皮的甲醇提取物進行研究，并采用活性跟蹤的方法對其活性成分進行分離，具有除草作用的化合物為黃皮素內酯Ⅱ（2′，3′－epoxyanisolactone，結構為圖1）。結果表明，在80μg／mL時，黃皮素內酯Ⅱ對稗草 （Echinochloa crusgalli Linn.）的根長、莖長和鮮重抑制率分別為96.00%、84.71%和89.85%，其IC50值分別為66.9、78.4μg／mL和133.0μg／mL［11－12]。表明黃皮素內酯Ⅱ對稗草具有顯著的抑制活性，作為植物源除草劑具有一定的開發和應用前景。黃皮素內酯Ⅱ在國內為首次從黃皮中分離并確定其具有除草活性，為了科學合理利用黃皮資源，為開發新型除草劑提供依據，作者對黃皮植株地上部位黃皮素內酯Ⅱ的含量進行測定，并測定該化合物對稗草生理生化代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

稗草（E.crusgalli L.）屬禾本科，稗屬。種子采于華南農業大學農場，置于冰箱內4℃保藏備用。

黃皮素內酯Ⅱ：黃皮的果核、枝葉和花分別采自華南農業大學昆蟲毒理室標本園，在花期采集枝葉和花，成熟期采集種子，陰干后粉碎，用甲醇浸泡提取，m（粉碎物）∶V（甲醇）＝1∶3，旋轉蒸發儀濃縮后得其粗提物，然后對粗提物進行硅膠柱層析和薄層層析后，分離純化得白色結晶，經核磁共振氫譜（1HNMR）（500MHz）和核磁共振碳譜（13CNMR）（125MHz）分析后，綜合以上特征并參考文獻報道鑒定為黃皮素內酯Ⅱ（由中國科學院華南植物園魏孝義研究員進行結構鑒定）。

圖1 黃皮素內酯Ⅱ

1.2 黃皮素內酯Ⅱ含量的測定

標準工作曲線的制作：稱取黃皮素內酯Ⅱ，用甲醇（100%）分別配制200、100、50、25μg／mL和12.5μg／mL的標樣，過濾后經HP－1100型高效液相色譜儀（美國惠普公司生產）進行檢測，在212nm檢測各濃度的峰面積和出峰時間，重復3次，建立相應的色譜條件。并以物質濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。

色譜條件：色譜柱為HP Hypersi ODS C18250×4.0mm（i.d）5μm；柱溫：室溫；流動相：V（甲醇）∶V（水）＝75∶25；流速：1.0mL／min；檢測波長：212nm；進樣量10μL；保留時間：約3.906min。

分別配制黃皮素內酯Ⅱ的濃度梯度，濃度分別為200、100、50、25、12.5μg／mL，在上述檢測條件下測定各濃度的峰面積，以其濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

在儀器完全穩定的狀態下，取一含量為98.52%黃皮素內酯Ⅱ的樣品，連續進樣6次，計算出標準偏差和變異系數。

5mL濃度為100μg／mL黃皮素內酯Ⅱ樣品溶液中，添加濃度為100μg／mL黃皮素內酯Ⅱ標準品3、4、5、6、7、8mL，則添加的質量分別是0.300、0.400、0.500、0.600、0.700mg和0.800mg，進樣分析后，扣除樣品中原有的黃皮素內酯Ⅱ的含量，計算分析方法的準確度。

含量的測定：分別稱取0.05g枝葉、花和果核的粗提物各3份，用10mL甲醇（100%）溶解，微孔濾膜（孔徑0.45μm）過濾后，采用上述液相色譜條件進行檢測。

1.3 氨基酸總量的測定

參考山東農業大學的方法［13]，稍加改進。

藥劑的設計：稱取一定量的甲醇萃取物，用1mL N，N－二甲基甲酰胺和少量吐溫－80溶解后，加蒸餾水配成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL 5個濃度，以1mL N，N－二甲基甲酰胺和少量吐溫－80為對照。

稗草的培養（小杯法）：取25mL的小燒杯，往杯內加入小玻璃珠，以鋪滿燒杯底部為宜，振動小燒杯使玻璃珠面達到平整，再往珠面上墊上一層新華牌定性濾紙，濾紙大小與杯口內徑大小一致，選取發芽一致的稗草種子20粒，用鑷子均勻地放在濾紙上，燒杯內加入5mL配制好的不同濃度的萃取物液，重復3次，放在光照培養箱中28℃恒溫下培養。10d后觀察結果。

氨基酸樣品提取液的制備：10d后取出各處理的稗草植株，用剪刀剪下葉片和根部，并將其剪成碎片（2mm左右）。迅速稱取樣品0.15g，重復3次，加入10mL蒸餾水，加熱至沸，冷卻后用單層濾紙過濾備用。

樣品氨基酸含量的測定：吸取上述樣品提取液1mL，加入1mL水合茚三酮溶液，在80℃恒溫水浴中加熱15min，取出后用pH5.0的檸檬酸緩沖液稀釋至10mL，在721型分光光度計610nm處測定吸光密度值，再從標準曲線上查出相應的氨基酸微克數。根據公式分別求出每克鮮樣品含氮量，根據公式計算含氮量比。

式中，C為由標準曲線查出每毫升提取液中氨基態氮含量（微克）；Vt為樣品提取液經稀釋后的體積（mL）；L為測定時取樣品液毫升數；W 為樣品。

1.4 樣品蛋白含量的測定

以牛血清白蛋白為標準蛋白，按照鄒琦［14]的方法進行蛋白含量的測定：前處理方法同1.3，稱取稗草植株0.15g，重復3次。放入研缽中，加入1.5mL蒸餾水，研磨成勻漿，－4℃13 000r／min下冷凍離心15min。吸取上清液0.02mL放入具塞試管，加入5mL考馬斯亮藍G－250溶液和0.98mL蒸餾水，在595nm下測定A值，查得蛋白含量。按公式計算樣品中的蛋白含量。

式中，C為查標準曲線值（μg）；Vt為提取液總體積（mL）；W 為樣品鮮重（g）；V1為測定時加樣量（mL）。

2 結果與分析

2.1 黃皮素內酯Ⅱ在黃皮不同組織中的含量測定

在給定的液相色譜檢測條件下測定各濃度的峰面積，以其濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得到黃皮素內酯Ⅱ的高效液相色譜工作曲線為y＝37.936x＋94.54，相關系數為R＝0.999 9。

在儀器完全穩定的狀態下，取一含量為98.52%的樣品，連續進樣6次，計算出標準偏差0.145 1，變異系數0.147 2%。

添加一定質量的黃皮素內酯Ⅱ標準品進樣分析后，扣除樣品中原有的黃皮素內酯Ⅱ的含量，測定出回收率分別是98.49%、100.18%、99.68%、99.72%、100.09%和99.73%，平均回收率為99.65%。

分別配制黃皮的花、枝葉和果核的粗提物1 000μg／mL的濃度，在設定的檢測條件下測定各部分中化合物黃皮素內酯Ⅱ的含量，測定結果見表2。結果表明，黃皮素內酯Ⅱ在花粗提物中的含量較少，僅為0.43%，在枝葉和果核中的含量分別為3.33%和3.21%。這說明黃皮素內酯Ⅱ在黃皮枝葉和果核中的含量較高，且枝葉材料容易獲取，為從枝葉中提取黃皮素內酯Ⅱ的可行性提供了條件。本試驗所用材料枝葉和花取于花期，果核取于成熟期，所以枝葉中黃皮素內酯Ⅱ的含量較高是僅限于花期這個時期取樣的。

表1 化合物黃皮素內酯Ⅱ在黃皮不同組織的含量1）

2.2 對稗草氨基酸代謝的影響

植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進行運輸，測定氨基酸總量是研究植物根系生長和整個生長發育的一個指標。黃皮素內酯Ⅱ在設定的0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL的濃度梯度下，對稗草植株中的氨基酸含量有一定的影響，樣品含氮量分別為1.402 8、1.317 2、1.250 2、1.128 7mg／g和0.903 2mg／g，比對照0.832 1mg／g均有所增加，且各處理與對照差異顯著。試驗結果表明黃皮素內酯Ⅱ使稗草的氨基酸含量有一定的增加，氨基酸是合成蛋白質等營養物質的基礎，而試驗中觀察到處理稗草表現為頂端生長點鈍化、畸形，植株矮小，根部不發達，表現出營養供應不足。分析原因可能是黃皮素內酯Ⅱ阻礙了稗草氨基酸轉化為蛋白質的過程，使氨基酸在一定時期內表現為積累。

表2 黃皮內酯Ⅱ處理稗草氨基酸含量的變化

2.3 對稗草植株蛋白代謝的影響

分別設定0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL 5個濃度梯度處理稗草植株。結果表明，各處理稗草的蛋白含量與對照相比都有所下降，在處理濃度下，蛋白含量比對照分別降低75.91%、66.43%、62.43%、58.57%和58.03%。且各處理蛋白含量均與對照差異顯著。這一結果結合2.2中的結果表明黃皮素內酯Ⅱ對稗草植株內氨基酸轉化為蛋白質有一定的影響，導致蛋白含量降低，從而影響到稗草的正常生長。

表3 黃皮素內酯Ⅱ處理稗草蛋白含量的變化

3 討論

化學除草不僅造成環境污染，還會對作物或非靶標生物產生藥害以及產生嚴重的抗藥性問題。植物次生代謝物質是生物間協同進化的結果，易于在自然界循環中降解，而且次生代謝物質具有多樣性和復雜性的特點，不容易產生抗性。因此，從自然界生物中尋找具有除草活性的化合物，已成為研發環境相容性除草劑的一條重要途徑。例如，除草劑環庚草醚（通用名為cinmethylin）是來源于植物性化合物1，4－桉樹腦；而捷利康公司開發的新型除草劑Triketones，則是來自植物的次級代謝產物Leptospermone。天然產物不同尋常的結構特征使其擁有與傳統除草劑不同的作用靶標［15－16]。因此，對有植物毒性的天然產物進行研究，有望發現具有新型作用機制的除草化合物，從而開發出新型安全的除草劑。

除草活性測定表明，黃皮植物體內次生代謝產物黃皮素內酯Ⅱ對稗草生長具有顯著抑制作用，經過測定它主要分布在植物的枝葉內，這為合理利用這種化合物提供了依據。黃皮素內酯Ⅱ在國內首次從該植物中分離，經試驗測定對稗草植株生長具有很好的抑制活性。本試驗研究結果表明，經黃皮素內酯Ⅱ處理后，稗草植株內的氨基酸含量升高，蛋白含量降低，這是稗草植株在受到刺激后，體內的蛋白質代謝受到干擾，很可能是黃皮素內酯Ⅱ抑制稗草植物生長的作用機制之一，為尋找新的除草靶標，開發新農藥奠定基礎。

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