劉東明， 束長龍， 宋福平， 高繼國， 張 杰

（1．東北農業大學生命科學院，哈爾濱 150030；2．中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

蘇云金芽胞桿菌（Bacill us thuringiensis，簡稱Bt）是一種革蘭氏陽性細菌，在形成芽胞的同時能產生由cr y與cyt基因編碼的、對多種害蟲具有高毒力的殺蟲晶體蛋白（insecticidal cr ystal pr otein，簡稱ICP）。由于其對害蟲特異的殺蟲活性，對人畜無害且不污染環境等優點，Bt已經成為最為有效的微生物殺蟲劑，廣泛應用于害蟲的生物防治［1］。分離新型高效的Bt菌株與殺蟲基因對進一步開發Bt殺蟲劑與轉基因作物有重要的意義。

Bt廣泛存在于自 然界中，從 土壤［2－3］、水源［4－6］、昆蟲尸體［7］、野生動物［8－11］、植物表面［12］等都可以分離出Bt。其中，土壤作為微生物生存的最佳介質，是Bt菌株最直接的來源，并且樣品采集地的氣候、植被也會影響到Bt菌株分布［13］。因此，從不同氣候、地域特征的生態環境中采集土壤樣品，有利于篩選到類型多樣的Bt菌株。

蘇云金芽胞桿菌休眠的芽胞在75℃的亞致死溫度下處理15 min，活化效果最好［14］，依據這一特性采用溫度篩選分離Bt具有分離范圍廣，不易漏篩等優點。獲得的大量Bt野生菌株根據大質粒圖譜進行分型，質粒圖譜是菌株含有的質粒的瓊脂糖凝膠電泳條帶，與菌株含有的質粒數量、大小以及拷貝數都有關，可以作為區分不同菌株的證據［15］。采用PCR－RFLP方法鑒定Bt的殺蟲基因，不但具有快速、簡便的優點，而且既可鑒定出已知的基因又可檢測出未知的新基因，因此PCR－RFLP鑒定體系獲得了廣泛的應用［16－18］。

北京植物園位于北京西山風景區，占地400 h m2，收集展示各類植物10 000余種（含品種）150余萬株，在園內形成以植物類型劃分數十種小園區，形成了特殊的小型生態環境。本文從北京植物園不同園區收集了149份土壤樣本，進一步通過Bt菌株的分離、基因型鑒定以及殺蟲活性測定等工作，研究了這種特殊的小型生態環境中Bt菌株的多樣性與殺蟲活性。

1 材料與方法

1．1 土樣采集與菌株分離

從北京植物園的不同園區距表層5～10 c m之間的土層采集土壤樣品，采用溫度法［14］篩選Bt菌株，鏡檢觀察后畫線培養、分離保存。Bt標準菌株庫斯塔克亞種（B．thuringiensis subsp．kurstaki）HD－1基因類型為cr y1Ac、cr y2Aa、cr y2Ab，庫斯塔克亞種HD－73基因類型cry1 Ac，2株菌株均由實驗室保存。

1．2 蘇云金芽胞桿菌晶體類型觀察

顯微鏡樣品制備：將胞晶混合液滴于載玻片上，涂抹均勻，烘干固定，石炭酸復紅染液染色3 min，清水沖洗，100×油鏡進行鏡檢，石炭酸復紅染液配制方法參見文獻［19］。

掃描電鏡樣品制備：將Bt菌株在1／2 LB平板上畫線培養，30℃培養36 h，產生晶體。刮菌，滅菌水洗3次，12 000 r／min，10 min離心收集芽胞和晶體。用1 mL滅菌水懸浮。將菌液均勻涂于1 c m2薄玻璃片上，晾干。離子濺射噴金（2 n m），掃描電鏡觀察。

1．3 蘇云金芽胞桿菌質粒圖譜制備

提取Bt分離株的質粒DNA，質粒DNA提取方法、電泳方法參見文獻［20］。

1．4 蘇云金芽胞桿菌基因型的鑒定

采用PCR－RFLP的方法對cr y基因型進行鑒定。其中cr y1 基因鑒定方法參照文獻［21－22］；cr y2、cr y3、cr y4／cr y10 基因 鑒定方法參見文 獻［23］；cr y5～9基因鑒定方法參見文獻［24］；cry11～cr y40基因鑒定引物參見文獻［25］。

1．5 蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白的分析

SDS－PAGE分析方法參見文獻［26］。

1．6 室內殺蟲活性測定

1．6．1 大猿葉甲

將菌株樣品培養，鏡檢發現產生晶體后，取Bt原培養液10 mL離心去上清，用10 mL滅菌水重懸，另取10 mL滅菌水作為對照，樣品均勻涂布在新鮮的油菜葉上，晾干，放入生測瓶中，每瓶接初孵幼蟲20頭，每個處理重復3次，25℃生化培養箱中保溫，培養48 h后調查死、活蟲數，并觀察幼蟲取食情況，計算校正死亡率。試蟲的選取參見文獻［27］。

1．6．2 小菜蛾

菌株樣品培養與處理同1．6．1，另取10 mL滅菌水作為對照，樣品均勻涂布在新鮮的甘藍菜葉上，晾干，放入生測瓶中，每瓶接2～3齡幼蟲20頭，每個處理重復3次，25℃生化培養箱中保溫，培養48 h后調查死、活蟲數，并觀察幼蟲取食情況，計算校正死亡率。

2 結果與分析

2．1 菌株分離與晶體形態

利用溫度篩選法，共篩選出542株芽胞桿菌，進一步染色鏡檢顯示，其中147株含有晶體，為Bt菌株，各園區土樣分離菌株信息見圖1。這些菌株含有的晶體類型包括大菱形、小菱形、球形、方形和不規則形等。進一步挑選代表性菌株進行掃描電鏡拍照觀察，結果見圖2。

2．2 蘇云金芽胞桿菌質粒圖譜分析

通過分析北京植物園中所分離出的147株Bt菌株的質粒圖譜，對其結果進行比對，把帶型相同的菌株進行歸類，最后得到12種類型的Bt菌株（圖3），將其代表菌株命名為Z WY－1～Z WY－12。12株分離株與2株標準菌株的質粒圖譜比對，發現北京植物園篩選的Bt菌株帶型豐富多樣。

圖3 Bt菌株質粒圖譜分析

2．3 Bt菌株的cry基因型鑒定

采用PCR－RFLP方法，對12株Bt進行了cry基因的鑒定，結果見表2。結果表明：有6種類型的Bt菌株鑒定出了已知基因類型，而其他6種不含有已知基因型；鑒定出的基因型有cr y1Aa、cr y1Ab、cr y1Ac、cry1Ah、cry1Ba、cr y1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab、cr y7Aa；沒有檢測出cr y3～cr y6、cr y8～cr y40等基因。

2．4 殺蟲晶體蛋白的SDS－PAGE分析

通過SDS－PAGE分析了12株Bt所表達的Cry蛋白分子量，結果見圖4，列于表2。其中Z WY－5表達約70 ku的蛋白，Z WY－11、12表達約150 ku的蛋白，其余都表達約130 ku的蛋白，ZWY－1、3、8還表達了60 ku的蛋白。

圖4 分離菌株殺蟲晶體蛋白SDS－PAGE電泳分析

2．5 小菜蛾、大猿葉甲的生物活性測定

小菜蛾和大猿葉甲的測定結果見表2，其中Z WY－1、3、4、6、8、9對鱗翅目菜蛾科小菜蛾的校正死亡率達到了100%，ZWY－4、7對鞘翅目葉甲科大猿葉甲有較好活性。

表2 分離菌株cr y基因型鑒定及殺蟲生測結果1）

3 討論

近幾年來，國內很多學者從我國不同地域的土壤中分離到高毒力的Bt菌株，如束長龍等人在北京、海南、福建、甘肅等地的土壤樣品中分離到對小地老虎有高活力的菌株［28］；胡曉婷等人在河北、山東等地的土壤樣品中分離到對銅綠麗金龜幼蟲有活性的Bt菌株［29］；張靈玲等人在武夷山自然保護區的土壤樣品中分離到對白紋伊蚊有很高活性的Bt菌株［30］。

北京植物園具有多種高度人工化的小型生態環境，在這種環境下分析Bt菌株的多樣性與分布特點的研究工作尚屬首次。本文從北京植物園分離得到147株Bt菌株，分離率很高，進一步的質粒圖譜分析顯示這些菌株屬于12種不同的類型，并且其表達蛋白、基因類型以及晶體形態都有較好的多樣性。值得注意的是，菌株類型在植物園的各園區分布上有較強的園區特異性：宿根園、芍藥園、月季園、碉樓中有多種類型Bt菌株分布；而Z WY－9只在棧道入口有分布，Z WY－10只在臥佛山莊中分布。這種現象可能與植被類型及人類活動有關：宿根園、芍藥園和月季園的植物花朵艷麗、氣味芬芳，有利于吸引昆蟲，而碉樓處于植物園較偏僻的區域，附近缺乏觀賞性強的植物種類，人為的活動較少，適合昆蟲棲息繁殖，因而這幾個區域昆蟲種類、數量較多，有利于Bt菌株的擴繁，進而有較好的多樣性。由此可見，為了分離到多樣性較好Bt菌株，采集樣品時，不僅要考慮生態環境、人為活動的影響，植被類型的多樣性也是非常重要的決定因素。

本研究中檢測到的基因類型有cry1Aa、cr y1Ab、cr y1 Ac、cr y1 Ah、cr y1 Ba、cr y1Be、cr y1Ia、cr y1La、cr y2Ab與cr y7Aa等，SDS－PAGE結果顯示含有上述基因類型的菌株有60 ku與130 ku的蛋白條帶，其中130 ku的蛋白條帶屬于cr y1A、cr y1B、cr y1L 以及cr y7等基因的編碼產物，60 ku屬于cry2類基因的編碼產物，但是沒有檢測到81 ku的cr y1I類基因編碼的蛋白，說明這些菌株中的cr y1I類基因與其他已報道的基因相同，是沉默基因［20］。

在鑒定過程中有6種類型的Bt菌株沒有檢測到常見的cr y基因型，而掃描電鏡檢測可以確定其產生規則的晶體，SDS－PAGE分析其大量表達70、130、150 ku的蛋白，說明這些菌株含有的基因類型與目前常見的高毒基因不同。而其中的Bt菌株Z WY－7和Z WY－9分別對鞘翅目大猿葉甲和鱗翅目小菜蛾具有較好的殺蟲活性，說明這兩株菌株中可能含有新型高效的殺蟲基因。目前這兩株菌正在進行全基因組測序，這對分離新型高效的殺蟲基因有重要的意義。

本研究通過對北京植物園各園區分離的菌株進行分型、基因鑒定、殺蟲蛋白類型分析、活性分析，不僅得到新型高效的Bt菌株，還系統地分析了菌株分布與園區植被類型的關系。研究成果不僅為新型殺蟲基因的發掘提供了優質材料，而且為進一步的樣品采集提供了參考依據。

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