林 麗綜述 鄭 磊＊審校

腫瘤的發生發展是一個多基因參與，多因素、多步驟的復雜的生物學過程。腫瘤剛發生時多為器官局限性疾病，絕大多數腫瘤組織通過其脫落細胞進入血液循環，進而侵襲其它臟器進行遠處轉移。早于1869年，Ashworth在一例腫瘤死亡患者外周血中發現了類似腫瘤細胞，并首次提出循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTCs）的概念［1］。CTCs定義是指自發的或者因診療操作由實體瘤或者轉移灶釋放進入外周血中進行循環的腫瘤細胞［2］。CTCs的檢測可能有效地應用于體外早期診斷、化療藥物的快速評估、腫瘤復發的監測以及抗腫瘤新藥物的開發等。但由于腫瘤患者血液中CTCs數量稀少，大約每105～107個單核細胞中才有一個CTCs［3］，而且其精確分離比較困難，因此限制了CTCs的應用。近年來，隨著腫瘤轉移機制研究的深入，尤其是伴隨現代檢測技術的進步，對惡性腫瘤患者篩查并監測CTCs逐漸被臨床所重視。目前針對CTCs的檢測技術主要包括細胞富集技術和鑒定技術兩大類。富集技術主要是通過一些物理或化學原理將這些細胞特異性地收集起來，提高CTCs檢測的敏感性；鑒定技術則主要依靠腫瘤細胞上存在的一些腫瘤特異性或器官特異性標記以及腫瘤細胞本身的形態學特征來檢測CTCs。在實際操作中常常需要選擇兩者中的不同方法加以有效結合，以達到較高的檢測敏感性和特異性。本文就微量CTCs檢測技術的研究進展作一綜述。

1 富集技術

1.1 細胞過濾技術 （Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells，ISET）

ISET的基本原理是通過過濾工具將不同大小的CTCs和血液中其它細胞分離開來。其中，Vona等［4］建立的膜濾過法是利用上皮腫瘤細胞比外周血細胞大，而將上皮腫瘤細胞分離。該方法敏感度高，1ml血中只摻入1個腫瘤細胞也可檢出，分離得到的腫瘤細胞形態完整，表面各種抗原或分子標記保存完好，為后續相關檢測提供了良好的條件。此外，該方法對設備、技術要求不高，過程易于掌握。但是膜濾過法只能用于分離直徑大于8μm的腫瘤細胞。由于目前還沒有報道證實所有的腫瘤細胞直徑都大于8μm，使其分離靈敏性受到質疑［5］。而且所富集的細胞中不僅包括腫瘤細胞，也可能有不同種類的其它細胞（特別是單核細胞），使后續細胞鑒定結果出現假陽性，因而限制了本方法的應用。

1.2 密度梯度離心法（Density Gradient Centrifugation，DGC）

DGC和ISET一樣，也是運用物理方法富集和篩選有核細胞，其主要原理是采用特定介質在離心管內形成連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力的作用使細胞分層、分離。離心后，從上往下依次是：血漿成分、單個核細胞（淋巴細胞、單核細胞、腫瘤細胞等）、分離液、中性粒細胞和最下層的紅細胞。但是如果全血與分離液混合后不立即進行離心，血細胞內有可能摻入分離液而不利于分離，且腫瘤細胞有時可遷至血漿層，造成分離過程中丟失腫瘤細胞［6］。在此基礎上建立起來的OncoQuick分離法［7］，雖然對腫瘤細胞的平均回收率更高，富集效果更好，但在分離過程中仍可能丟失少量腫瘤細胞。

1.3 免疫磁珠分選法（Immunomagnetic Separation，IMS）

IMS是基于腫瘤細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單克隆抗體相結合，繼而在外加磁場中通過相應抗原抗體復合物與磁珠吸附而滯留在磁場中，沒有表面抗原的其它細胞由于不能與連接磁珠的特異性單克隆抗體結合而不能在磁場中停留，從而使腫瘤細胞得以分離［2］。該方法能夠從多種細胞中篩選出帶有特異性標記的極少量腫瘤細胞。而后發展的磁珠技術多采用上皮細胞黏附分子（EpCAM）抗體來捕獲腫瘤細胞［8］，但其不足是EpCAM抗體結合磁珠存在著特異性差、結合能力低、易失活等缺點。針對抗體的缺點，Ellington等［9］用指數富集的配體系統進化技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmen，SELEX）發現了能夠特異性結合于染料小分子的RNA配體，并命名為適配體（適體），以指代從SELEX技術中針對靶標系統進化出的核酸配體。適體具有特異性高、親和力強、易合成、易修飾等特點，因此近些年許多研究者著眼于利用EpCAM適體來提高腫瘤細胞的富集效率［10，11］。也有學者如 Xu等［12］發展了免疫磁珠分離方法，將表達去唾液酸蛋白受體的肝細胞癌（HCC）細胞與生物素化去唾液酸蛋白結合后，再與抗生物素抗體涂布的磁珠一起孵育，使去唾液酸蛋白與蛋白受體-磁珠結合來分離HCC。該方法平均回收率大于61%，較其它分離方法高，且平均每5ml外周血中可檢測到19±24個CTCs，是肝癌患者CTCs敏感而特異的分離和計數方法。

2 鑒定技術

2.1 免疫細胞化學法（Immunocytochemistry，ICC）

ICC是利用抗原與抗體特異性結合的原理，使顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素等）標記的抗體與特異的腫瘤標志物如上皮細胞角蛋白（CK）、上皮細胞膜特異性抗原、腫瘤相關糖蛋白（TAG）等結合，通過酶和底物反應顯色等方法來鑒定腫瘤細胞的存在。與核酸分離方法相比，免疫細胞化學方法的優點在于腫瘤細胞未被破壞，可以進行后續形態學鑒別或核酸特征分析。但不足之處是缺乏腫瘤特異性抗體，敏感性也低，只能從（1～10）×105個正常細胞中發現1個腫瘤細胞，且每個載玻片上所能檢測的細胞載量僅為5×105個細胞［13］，難以從外周血大量單核細胞中檢測出極少量的腫瘤細胞，難以滿足臨床診斷需要。為了能在更大范圍檢測到外周血中稀少的腫瘤細胞，近年來研發出光纖陣列掃描術（Fiber Array Scanning Technology，FAST）［14］，激光掃描細胞計量儀（Laserscanning Cytometry，LSC）［15］等，它們能夠在傳統的顯微鏡技術基礎上高速掃描并快速、準確定位免疫熒光標記的腫瘤細胞，使檢測敏感性和實用性得到顯著提高。

2.2 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

PCR技術檢測腫瘤患者外周血中CTCs主要是通過檢測癌基因、抑癌基因的突變或染色體異位產生的異常DNA。雖然敏感性高［能從（1～10）×106個正常細胞中檢測出1個腫瘤細胞］，但是由于其易出現假陽性，適用范圍有限，而且外周血中CTCs和核酸的半衰期不穩定，檢測到的游離DNA可能并非真正腫瘤細胞，因此應用PCR技術通過DNA標記檢測CTCs的特異性不高，在臨床實踐中還不能達到理想的效果［16］。RT-PCR檢測CTCs是在PCR基礎上擴增由腫瘤特異性mRNA序列逆轉錄的DNA片段，從而識別組織或腫瘤特異性mRNA的表達或某些基因改變后RNA水平的異常。這些mRNA幾乎不表達于正常外周血細胞，所以在外周血中檢測到特異mRNA可以間接提示CTCs的存在。與PCR技術相比，盡管RT-PCR可確認某些基因的表達，提高對腫瘤細胞mRNA表達的鑒別能力，但其存在的取樣時上皮細胞污染、腫瘤標志物在外周血的非正常表達或者假基因干擾等原因可導致假陽性結果，另外，RT-PCR無法進行形態學觀察及對腫瘤細胞定量是影響它應用于CTCs檢測的最大障礙。

2.3 流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）

FCM是一種集激光、電子物理、光電測量、計算機、細胞熒光化學和單克隆抗體為一體的新型技術，主要用于腫瘤細胞DNA分析以及腫瘤相關標志物檢測。利用腫瘤細胞單克隆抗體結合熒光物質標記腫瘤細胞，可以對外周血樣本中的CTCs進行精確定量計數，以及檢測細胞DNA含量，預測腫瘤預后等。具有分析速度快、精度高、準確性好等優點。Fusi等［17］采用FCM探討了轉移性腫瘤（MC）和黑色素瘤（MM）的CTCs中趨化因子受體（CR，包括CXCR4、CCR6、CCR7和CCR9）的表達，結果發現，CTCs的檢測效率達到72%，平均每10ml血液中檢測到3個CTC；在檢測到CTC的患者中，趨化因子受體CXCR4表達最高，達82%，CCR6表達為59%；在MM患者中，CCR9表達為57%，而CR7表達只有29%，這種準確測量表明CTC與細胞表面CR表達呈正相關，與器官特異性轉移模式無顯著相關性。Hristozova等［18］利 用FCM 分析CD45的EpCAM 和CK陽性的CTC對晚期頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）傳播的作用，結果顯示這種CTCs與頭頸部鱗狀細胞癌區域性轉移有關。不過，單純依賴FCM測定CTCs的敏感性仍存在爭議，建議通過與細胞富集技術（如磁珠富集）聯合，以提高FCM的敏感性和鑒別力，提高CTCs的陽性檢出率。

2.4 微流控技術（Microfluidics）

芯片實驗室（Lab-on-a-Chip）是一個新興領域，原則上所有生物與化學實驗室功能的微型化手段都可以用“芯片實驗室”技術來指代。而其概念中的代表性技術就是針對小尺度液體操控的微流控技術。微流控技術可在微米級結構中操控納升至皮升體積流體，是近十年來迅速崛起的前沿交叉學科。Xu等［19］即用聚對二甲苯-C槽微流控裝置捕獲了有活性CTCs中的端粒酶。使用一個衡量低壓傳輸系統的新微流控技術平臺能在5min內從1ml全血實現90%CTCs捕獲和90%細胞活力。更重要的是，捕獲的CTCs經掃描電子顯微鏡觀察，其形態保持正常。此方法能捕獲和鑒定有活性CTCs，具有快速、簡便且準確定量的優勢，而且適用于任何實體瘤，有望成為一種新的CTCs定量檢測和表征方法。

Lin等［20］將健康志愿者血標本中摻入腫瘤細胞，來評估微流控技術捕獲CTC的敏感性，發現微流控裝置能從摻入5個CTC的7.5ml血中，至少檢測到1個CTC，并有大于90%的復蘇率。較多研究者［21～24］在微流控技術，特別在聯合運用適體或磁珠微流控技術檢測腫瘤細胞做了很多工作，有力地推進了微流控技術的發展和應用。目前基于微流控技術用于檢測腫瘤細胞最有運用前景的是微流控芯片，它把生物和化學等領域所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離與檢測等基本操作單元集成到一塊幾平方厘米的芯片上，具有快速、高效、高靈敏度等諸多優點，是實驗室分析的優良工具。微流控芯片技術進行CTCs檢測尚處起步階段，在芯片設計、材料選用、檢測技術聯用等方面仍存在許多不足，但它的出現已為CTCs檢測技術的發展提供了新的方法和思路。

3 富集與鑒定技術的結合

如上所述，目前用于CTCs檢測的方法很多，實際臨床應用中常常選擇不同方法的有效結合，使用最多的也是目前自動化程度最高的 系統［25］，該系統集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，人為因素干擾較少，具有較高的特異性、敏感性及可重復性，是目前唯一被美國FDA批準用于轉移性乳腺癌、結直腸癌或前列腺癌CTCs檢測的新技術［26］。其主要原理是用一種攜帶鐵微粒的抗體與CTCs特異性結合，再用強磁體將這些CTCs從血液樣本中提出，并進行生物或化學染色，從而準確識別CTCs。CellSearch系統檢測CTCs的效果已被許多研究者用于臨床，Gazzaniga等［27］用CellSearch系統分析CTC對非肌肉侵蝕性膀胱（NIMIBC）的影響，發現CTC的存在與NIMIBC首次復發的時間長短密切相關；NIMIBC中檢測CTC能區分高復發風險，有利于腫瘤的早期診斷。Farace等［28］用CellSearch系統和ISET檢測了轉移性乳腺癌、前列腺癌和肺癌共60例患者的CTCs，結果顯示乳腺癌CTCs檢測率55%、前列腺癌60%、肺癌20%，這種差異主要取決于腫瘤類型。

最近，許多學者研究了一些新的用于檢測CTCs的方法。Hughes等［29］設計的檢測CTC的微量流動裝置是利用E-選擇素和針對上皮細胞的抗體分子，采用埃洛石納米顆粒和納米材料合成，該裝置CTCs捕獲率大約為50%，可以從3.75ml樣本中分離到20～704個CTC，高于CellSearch系統的捕獲率（P＜0.01）；Kirb等［30］發明了一種提高捕獲率，減少非特異性細胞黏附的方法——GEDI（幾何學提高特異性免疫捕獲）微流量裝置，該裝置將前列腺特異性膜抗原（PSMA）抗體和3維（Three Dimensional，3D）立體幾何學結合，結果顯示該裝置敏感度比CellSearch系統提高2～400倍；還有研究者［31］將鄰位連接技術（PLA）和針對細胞表面的特異性RNA適體結合起來用于檢測CTCs，結果發現這種方法能特異地檢測和區分特異性表達前列腺癌膜抗原（PMA）的腫瘤細胞，雖然特異性和敏感度不夠明確，但其應用前景還是十分樂觀的。

4 小 結

近年來，CTCs檢測作為一種可重復的非侵入性診斷工具，在實體瘤轉移的早期診斷及預后評估中發揮著越來越重要的作用。目前CTCs的檢測方法多種多樣，在一定程度上滿足了臨床需求，但都存在一定的缺點而影響其廣泛應用，如PCR被認為是檢測CTCs和轉移性腫瘤的理想而常規的技術之一，然而PCR陽性并不意味著疾病復發；聯合RTPCR、流式細胞術和免疫細胞化學方法能大大提高腫瘤細胞的臨床價值，但真正已經進入臨床的只有CellSearch系統，其它方法仍處于研究階段。而臨床診斷卻渴求更為快速、簡便的分析方法來捕獲特異性CTCs。新技術的出現將給CTCs檢測方法的發展帶來機遇，如微流控芯片的出現為CTCs檢測實現臨床個體化治療提供了新的技術平臺，而PLA和適體聯用也將成為未來CTCs檢測研究的熱點。總之，CTCs檢測有望成為一種具有高度可行性、信息含量豐富且準確的新型診斷方法，從而為腫瘤患者的診治帶來新的希望。

1 Ashworth TR.A case of cancer in which cells similar to those in the tumours were seen in the blood after death［J］.Aus Med J，1869；14：146～147.

2 Pachmann K，Clement JH，Schneider CP，et al.Standardized quantification of circulating peripheral tumor cells from lung and breast cancer［J］.Clin Chem Lab Med，2005，43（6）：617～627.3 Ross AA，Cooper BW，Lazarus HM，et al.Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stem cell collections from breast cancer patients using immunocytochemical and clonogenic assay techniques［J］.Blood，1993，82（9）：2 605～2 610.

4 Vona G，Sabile A，Louha M，et al.Isolation by size of epithelial tumor cells：a new method for the immunomorphological andmolecular characterization of circulatingtumorcells［J］.Am J Pathol，2000，156（1）：57～63.

5 Zigeuner RE，Riesenberg R，Pohla H，et al.Immunomagnetic cell enrichmentdetects more disseminated cancer cells than immunocytochemistry in vitro［J］.J Urol，2000，164（5）：1 834～1 837.

6 Gertler R，Rosenberg R，Fu ehrer K，et al.Detection of circulatingtumor cells in blood usingan optimized densitygradient cen trifugation［J］.Recent Results Cancer Res，2003，162（2）：149～155.

7 Rosenberg R，Gertler R，Friederichs J，et al.Comparison of two density gradient centrifugation systems for the enrichment of disseminated tumor cells in blood［J］.Cytometry，2002，49（4）：150～158.

8 Antolovic D，Galindo L，Carstens A，et al.Heterogeneous detection of circulating tumor cells in patients with colorectal cancer by immunomagnetic enrichment using different EpCAM-specific antibodies［J］.BMC Biotechnol，2010，10：35～42.

9 Ellingtion AD，Szostak JW.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands［J］.Nature，1990，346（6287）：818～822.

10 Shiqdar S，Lin jia，Yu Y，et al.RNA aptamer against a cancer stem cell marker epithelial cell adhesion molecule［J］.Japanese Cancer Association，2011，102（5）：991～998.

11 Walter JG，Petersen S，Stahl F，et al.Laser ablation-based one-step generation and bio-functionalization of gold nanoparticles conjugated with aptamers［J］.Journal of Nanobiotechnology，2010，8：21～31.

12 Xu W，Cao L，Chen L，et al.Isolation of circulating tumor cells in patients with hepatocellular carcinoma using a novel cell separation strategy［J］.Clin Canccer Res，2011，17（11）：3 783～3 793.

13 Sieuwerts AM，Kraan J，Bolt J，et al.Anti-epithelial cell adhesion molecule antibodies and the detection of circulating normallike breast tumor cells［J］.J Natl Cancer Inst，2009，101（1）：61～66.

14 Somlo G，Lau SK，Frankel P，et al.Multiple biomarker expression on circulating tumor cells in comparison to tumor tissues from primary and metastatic sites in patients with locally advanced／inflammatory，and stage IV breast cancer，using a novel detection technology［J］.Breast Cancer Res Treat，2011，128（1）：155～163.

15 Scholtens TM，Schreuder F，Liqthart ST，et al.CellTracks TDI：an image cytometer for cell characterization［J］.Cytometry Part A，2011，79（3）：203～213.

16 Ji XQ，Sato H，Tanaka H，et al.Real-time quantitative RTPCR detection of disseminated endometrial tumor cells in peripheral blood and lymph nodes using the lightcycler system［J］.Gynecol Oncol，2006，100（2）：355～360.

17 Fusi A，Liu Z，Kummerlen V，et al.Expression of chemokine receptors on circulating tumor cells in patients with solid tumors［J］.J Trans Med，2012，10：52～58.

18 Hristozova T，Konschak R，Stromberger C，et al.The presence of circulating tumor cells（CTCs）correlates with lymph node metastasis in nonresectable squamous cell carcinoma of the head and neck region（SCCHN）［J］.Ann Oncol，2011，22（8）：1 878～1 885.

19 Xu T，Lu B，Tai YC，et al.Cancer detection platform which measures telomerase activity from live circulating tumor cells captured on microfilter［J］.Cancer Res，2010，70（16）：6 420～6 426.

20 Lin HK，Zheng S，Willams AJ，et al.Portable filter-based microdevice for detection and characterization of circulating tumor cells［J］.Clin Cancer Res，2010，16（20）：5 011～5 018.

21 Sheng W，Chen T，Kamath R，et al.Aptamer-enabled efficient isolation of cancer cells from whole blood using a microfluidic device［J］.Anal Chem，2012，84（9）：4 199～4 206.

22 Fang X，Tan W.Aptamers generated from Cell-SELEX for molecular medicine：a chemical biology approach［J］.Acc Chem Res，2010，43（1）：48～57.

23 Xu Y，Phillips JA，Yan J，et al.Aptamer-based microfluidic device for enrichment，sorting，and detection of multiple cancer cells［J］.Anal Chem，2009，81（17）：7 436～7 442.

24 Phillips JA，Xu Y，Xia Z，et al.Enrichment of cancer cells using aptamers immobilized on a microfluidic channel［J］.Anal Chem.2009，81（3）：1 033～1 039.

25 Allard WJ，Matera J，Miller MC，et al.Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases［J］.Clin Cancer Res，2004，10（20）：6 897～6 904.

26 Cohen SJ，Punt CJ，Iannotti N，et al.Relationship of circulating tumor cells to tumor response：progression-free survival，and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer［J］.J Clin Oncol，2008，26（19）：3 213～3 221.

27 Gazzaniga P，Gradilone A，de Berardinis E，et al.Prognostic value of circulating tumor cells，in nonmuscle invasive bladder cancer：a CellSearch analysis［J］.Annals of Oncology，2012，23（9）：2 352～2 356.

28 Farace F，Massard C，Vimond N，et al.A direct comparison of CellSearch and ISET for circulating tumour-cell detection in patients with metastatic carcinomas［J］.Br J Cancer，2011，105（6）：847～853.

29 Hughes AD，Mattison J，Western LT，et al.Microtube device for selectin-mediated capture of viable circulating tumor cells from blood［J］.Clinical Chemistry，2012，58（5）：846～853.

30 Kirby BJ，Jodari M，Loftus MS，et al.Functional characterization of circulating tumor cells with a prostate-cancer-specific microfluidic device［J］.PLoS ONE，2012，7（4）：e35 976.

31 Pai SS，Ellington AD.Using RNA aptamers and the proximity ligation assay for the detection of cell surface antigens.Methods in Molecular Biology［J］.Biosensors and Biodetection，2009，504：385～398.