乙型肝炎病毒YMDD變異與病毒數量和藥物治療時間的關系

徐志勇 陳 婕 肖 榮 朱 凡＊

乙型肝炎是在我國廣泛流行，嚴重危害人民健康的常見傳染病。由于乙型肝炎病毒（HBV）聚合酶在催化RNA中間體到DNA負鏈的逆轉錄過程中缺少校正活性，使HBV在各種內源性（機體免疫變化）和外源性（藥物治療以及環境影響）壓力下，常常發生變異，特別是長期使用抗病毒藥物拉米夫定的HBV感染者，其體內可檢測到DNA基序酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸（YMDD）204位點突變（rtM204I／V），且常表現為野生株和變異株或是幾種變異株共生雜合狀態［1］。本文報道145例服用拉米夫定的乙肝患者發生HBV rtM204I／V位點突變與HBV數量和用藥時間的關系，為乙肝患者臨床個體化治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 檢測對象

選擇2008年6月～2011年8月來自武漢普仁醫院、武漢市江夏區人民醫院等醫療機構就診的145例乙肝患者（符合中華醫學會慢性乙型病毒性肝炎臨床診斷標準［2］），并排除其它病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、甲型肝炎病毒（HAV）、戊型肝炎病毒（HEV）和艾滋病毒（HIV）等導致的肝臟損害者；用藥初期rtM204I／V檢測陰性。

145例患者中男76例，女69例，平均年齡35.80±12.50歲。所有患者均連續接受葛蘭素史克制藥（蘇州）有限公司生產的賀普丁（拉米夫定）薄衣片（國 藥 準 字 H20030581，0.1g／片 ）治 療，口 服100mg，每日1次，治療時間6～24個月。后文兩種分組中各組年齡、性別、肝功能情況等差異均無統計學意義，具有可比性。

1.2 實時熒光定量PCR檢測HBV數量

采用真空促凝管采集患者治療結束后空腹靜脈血，離心后分離血清送檢。采用美國ABI 7300熒光定量PCR分析儀檢測HBV DNA數量，試劑盒來自艾康生物技術（杭州）有限公司，批號分別為國藥準字S20060017和國食藥監械（準）字2011第3401263號，最低檢測下限500IU／ml。具體反應體系的建立以及實驗步驟嚴格按照試劑盒和儀器說明書進行。

1.3 DNA測序

采用直接測序法。以熒光定量PCR檢測時提取的HBV DNA為模板，采用巢式PCR擴增HBV P區基因，兩對引物分別為：F1：5’-CTG CTC AAG GAA CCT CTA TG-3’，R1：5’-AGG TGA AGC GAA GTG CAC-3’；F2：5’-CAT CCT GCT GCT ATG CCT C-3’，R2：5’-GTT CAA ATG TAT ACC CAA AG-3’。PCR體系為50μl，含10×buffer（Mg2+plus）5μl，dNTP 0.2μM，上、下游引物各10pmol，高保真 Taq酶（日本 ToYoBo公司）1.25U，DNA模板2μl。PCR擴增條件為：94℃預變性2min；94℃ 30s，55℃25s，72℃ 40s，共35個循環；最后72℃延伸2min。對以上PCR產物進行電泳確認后，送上海英俊生物技術有限公司測序。

1.4 統計學處理

采用SPSS 15.0統計學軟件。計量資料用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HBV DNA數量與YMDD變異病毒

將 HBV DNA數量以105IU／ml為界線［3］，分為 HBV DNA≥105IU／ml組（B組，68例）和＜105IU／ml組（A組，77例）。分別對兩組YMDD rtM204I／V進行分析和比較，具體結果如表1：組間比較，B組的YMDD純合突變率高于A組，但其雜合突變率低于A組；組內比較，B組的純合突變率高于雜合突變率，A組的純合突變率低于雜合突變率，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表1 不同HBV DNA數量與YMDD突變率（n，%）

2.2 HBV YMDD突變率與治療時間

根據測序結果將145例患者分為未變異組（YMDD）、純 合 變 異 組 （YVDD、YIDD、YVDD／YIDD）和 雜 合 共 生 組 （YMDD／YIDD、YMDD／YVDD、YMDD／YVDD／YIDD），分析各組變異率和藥物治療時間。結果顯示，145例乙肝患者中，未發生變異者66例（45.52%），平均治療時間為252天；出現純合變異者46例（31.72%），平均治療時間為383天；出現雜合共生者33例（22.76%），平均治療時間為488天。統計分析表明，純合變異組突變率高于雜合共生組，但其拉米夫定治療時間短于雜合共生組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 HBV YMDD變異與藥物治療時間

3 討 論

慢性乙肝患者的治療是一個長期的過程，目前臨床上以核苷類藥物為主的抗病毒治療被普遍采用，隨之而來的是由藥物引起的病毒變異以及耐藥現象的出現。并且由于不同的病毒變異株對于相關藥物的反應效果以及采用的具體治療方案之間有著很大的差異，所以在明確患者體內的病毒數量以及相關免疫指標的同時，在臨床治療，特別是初診中還需要明確患者體內的病毒變異以及雜合共生狀態。

本文分析結果表明，乙肝患者HBV DNA≥105IU／ml組純合突變者比例顯著高于HBV DNA＜105IU／ml組。提示HBV數量較低時，乙肝患者體內可能處于多種病毒株雜合狀態，特別是那些長期治療而遷延不愈的病人，需優先考慮聯合用藥，以便對不同基因型毒株進行抑制［4］。而對病毒數量較高的病人，由于其體內病毒株可能比較單一，此時應盡量采用單一藥物治療。對于HBV純合突變與雜合共生狀態的關系，推測可能是體內不同病毒株相互抑制，導致每個單一毒株復制較慢，而使體內總病毒數量不高；但當其中某一個毒株在內外環境壓力下開始大量復制，其它毒株被完全抑制時，體內病毒株多為單一純合狀態［5］。但這種推測還需要大量實驗予以證實。

本實驗還證實HBV的變異與藥物拉米夫定治療的時間有關，治療時間較長者，容易產生YMDD變異（包括純合變異和雜合變異），這與Lai等［6］的觀察結果一致。

HBV變異是一個長期的、由單一野生純合狀態向多個變異株雜合共生狀態發展的過程。這種變異與目前臨床耐藥變化相吻合［7］。因此強調在對乙肝患者藥物治療時要注意控制總治療時間，盡量在治療早期取得效果，避免長期用藥引起HBV變異而給臨床治療帶來困難。

1 Mello FC，Lago BV，Lewis-Ximenez LL，et al.Detection of mixed populations of wild-type and YMDD hepatitis B variants by pyrosequencing in acutely and chronically infected patients［J］.BMC Microbiol，2012，12（1）：96～104.

2 賈繼東，李蘭娟.慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.肝臟，2011，16（1）：2～16.

3 乙型肝炎病毒耐藥專家委員會.乙型肝炎病毒耐藥專家共識［J］.中華預防醫學雜志，2009，43（9）：809～813.

4 Liu L，Tang YZ，Li JG，et al.Evolution of hepatitis B virus quasispecies during lamivudine-entecavir sequential therapy［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2010，18（6）：423～427.

5 Feng Liu，Li Chen，DM Yu，et al.Evolutionary patterns of hepatitis B virus quasispecies under different selective pressures：correlation with antiviral efficacy［J］.Gut，2011，60（9）：1 269～1 277.

6 Lai CL，Dienstag J，Schiff E，et al.Prevalence and clinical correlates of YMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B［J］.Clin Infect Dis，2003，36（6）：687～696.

7 Liang PP，Guo JJ，Li QL，et al.Evolution of hepatitis B virus quasispecies during antiviral therapy in one chronic hepatitis B patient［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi，2011，19（7）：516～520.