Caspase抑制劑F1013對刀豆蛋白A誘導小鼠急性肝損傷的治療作用

鄧利娟，李湛軍，羅 楹，范慧紅

(1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050;2.上海睿星基因技術有限公司，上海 201203)

急、慢性肝臟疾病是臨床上常見病、多發病，嚴重危害著人類健康。因此尋找高效低毒的抗肝損傷藥物一直是新藥研究領域的熱點之一。F1013為在研一類新藥，其化學名稱為3-(2-芐氧羰基氨基-3-甲基－丁酰胺基)-5-氟-4-氧代－戊酸，是人工合成的二肽衍生物，體外分子生物學及細胞學研究表明，F1013具有廣譜抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)的作用，在D-氨基半乳糖聯合脂多糖所致肝損傷模型中，F1013保肝降酶作用明顯［1－2］。本研究采用刀豆蛋白A(ConA)誘導的小鼠肝損傷模型，進一步探討F1013對急性肝損傷的治療作用及有關機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 F1013為白色粉末，純度為98.74%，批號為MC08261-27-2，由上海睿星基因技術有限公司提供。臨用時稱取150.0 mg F1013加8 ml丙二醇和2 ml pH 4.0的醋酸－醋酸鈉緩沖液，置60℃水浴攪拌30 min至完全溶解后，加生理鹽水65 ml配成2 g·L－1溶液，再用生理鹽水稀釋至所需濃度。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)，原料藥，日本Kyowa Hakko Kogyo公司產品，使用前用生理鹽水稀釋配制。

1.2 試劑和儀器 刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、RNase A 和Triton X-100均為美國Sigma公司產品;丙氨酸轉氨酶(ALT)，天冬氨酸轉氨酶(AST)和總膽紅素(TBil)(釩酸鹽法)試劑盒為中生北控生物科技股份有限公司產品;小鼠TNF-α ELISA試劑盒為北京四正柏生物科技有限公司產品。GS-15R低溫離心機(BECKMAN，德國);7060型全自動生化分析儀(HITACHI，日本);流式細胞儀(BD，美國);酶標儀(MD，美國);生物顯微鏡(OLYMPUS，日本)。

1.3 實驗分組及給藥 BALB/c小鼠60只，18～20 g，♂，SPF級，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供［SCXK(京)2009-0017］。按體重隨機分成6組:對照組、模型組、陽性藥組(NAC 155 mg·kg－1)和 F1013 高、中、低劑量組(5、2.5、1.25 mg·kg－1)，每組10只。實驗前禁食16 h，除對照組外，其他組均尾靜脈注射(iv)20 mg·kg－1ConA生理鹽水溶液造模。造模后2 h，陽性藥組腹腔注射(ip)NAC溶液，F1013給藥組和模型組分別皮下注射(sc)不同劑量的F1013溶液和溶媒。造模后8 h，小鼠眼靜脈叢取血，斷頭處死小鼠，留取血清和部分肝組織待檢。

1.4 病理學檢查 常規HE染色，肝組織病理變化用病理指數評定。評定標準為:“0”記整個肝切片無肝損傷病變;“1”記整個肝切片肝發生損傷病變＜1/3肝切片;“2”記整個肝切片肝發生損傷病變1/3～2/3肝切片;“3”記整個肝切片肝發生損傷病變＞2/3肝切片;每張切片2個視野評定，每組共20個視野評定，得分相加即為肝損傷的病理指數PI值。

1.5 血清生化指標的測定 用7060型全自動生化分析儀上測定血清ALT、AST和T-Bil。TNF-α的檢測采用ELISA法，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 流式細胞儀PI法定量分析大鼠肝細胞凋亡的檢測 將體積分數70%酒精固定的肝組織用網搓法制作成單細胞懸液，使每份所含細胞數不少于1×106個，用300目銅網過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液。取上述細胞懸液0.2 ml，加入碘化丙啶(PI)1 ml，在4℃冰箱染色30 min，采用流式細胞儀進行檢測，然后用Modifit LT 3.0分析。

2 結果

2.1 F1013對ConA所致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

2.1.1 肉眼觀察 對照組肝臟形態正常，被膜光滑、色澤紅潤、質地柔軟。模型組肝臟明顯腫脹，略顯蒼白，表面可見彌漫性出血點及散在淤斑，質地柔軟偏韌。其余各組肝臟表面散在點、片狀出血點面積較模型組小。

2.1.2 光鏡下觀察 對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝細胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，匯管區未見炎細胞浸潤，肝竇無擴張及淤血;模型組可見灶狀肝細胞核固縮，有核碎裂，散在凋亡小體，凋亡細胞胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞胞質染色異常，有空泡變性，細胞界限不清現象;壞死區大小不一，灶狀壞死區有出血、肝竇內紅細胞聚積;F1013(5，2.5 mg·kg－1)組和 NAC(155 mg·kg－1)組肝細胞損傷程度較模型組明顯減輕，但NAC(155 mg·kg－1)組減輕程度不及 F1013(5、2.5 mg·kg－1)組，如 Fig 1。

2.1.3 肝組織病理指數 從Tab 1可見，模型組病理指數明顯高于對照組(P＜0.01)，表明肝損傷程度非常嚴重，模型成立;F1013(5、2.5 mg·kg－1)組和NAC(155 mg·kg－1)組病理指數明顯低于模型組，其中，F1013(5 mg·kg－1)組差異具有顯著性(P＜0.05)。

2.2 F1013對ConA所致急性肝損傷小鼠肝功能的影響 經ConA造模后，模型組小鼠血清ALT，AST和T-Bil水平較對照組明顯升高(P＜0.01);F1013(5、2.5 mg·kg－1)組和 NAC(155 mg·kg－1)組小鼠血清ALT和AST水平較模型組明顯降低(P＜0.01 或 P ＜0.05);F1013(5、2.5、1.25 mg·kg－1)組小鼠血清 T-Bil水平較模型組降低，其中F1013(5 mg·kg－1)組差異具有顯著性(P ＜0.05)，如Tab 2。

Fig 1 Effects of F1013 on hepatic tissue of mice with acute liver injury induced by ConA(HE×200)

Tab 1 Quantitative evaluation of inflammation of hepatic histology in mice(±s，n=10)

Tab 1 Quantitative evaluation of inflammation of hepatic histology in mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1PI Control － 0.0 ±0.0 Model － 2.1 ±1.0＊＊NAC 155 1.9 ±0.8 F1013 5 1.4 ±0.5#2.5 1.5 ±0.8 1.25 2.2 ±1.2

2.3 F1013對ConA所致急性肝損傷小鼠血清TNF-α含量的影響 與正常對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α水平明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，F1013(5、2.5、1.25 mg·kg－1)組小鼠血清TNF-α水平明顯降低，其中 F1013(2.5、1.25 mg·kg－1)組差異具有顯著性(P＜0.05)，如Tab 3。

2.4 流式細胞儀檢測小鼠肝組織中細胞凋亡率模型組的肝細胞凋亡率較正常對照組明顯升高(P＜0.01)。F1013(5、2.5、1.25 mg·kg－1)組和 NAC(155 mg·kg－1)組肝細胞凋亡率較模型組明顯降低(P＜0.01)，呈現良好的劑量依賴性，如Fig 2和Tab 4。

Fig 2 Hepatocellular apoptosis in mice detected by FCM

Tab 2 Effects of F1013 on ALT，AST and T-BIL in serum of mice(±s，n=10)

Tab 2 Effects of F1013 on ALT，AST and T-BIL in serum of mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1 ALT/U·L－1 AST/U·L－1 TBil/μmol·L －1 Control 0 47 ±24 121 ±32 2.2 ±0.2 Model 0 6835±4231＊＊ 7150±4192＊＊ 10.9±4.1＊＊NAC 155 2596 ±1373## 3212 ±1569# 10.6 ±3.7 F1013 5 2138 ±959## 2552 ±1227## 3.4 ±1.4#2.5 2759 ±1951# 3041 ±2095# 7.9 ±2.7 1.25 4968 ±3260 5763 ±3774 9.4 ±3.0

Tab 3 Effects of F1013 on TNF-α in serum of mice(±s，n=10)

Tab 3 Effects of F1013 on TNF-α in serum of mice(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs model

Group Dose/mg·kg－1 TNF-α/ng·L －1 Control 0 0.00 ±0.00 Model 0 33.74 ±20.91＊＊NAC 155 30.96 ±18.52 F1013 5 22.31 ±4.28 2.5 18.42 ±8.27#1.25 17.71 ±7.85#

Tab 4 The result of hepatocellular apoptotic rate in mice detected by FCM(±s，n=10)

Tab 4 The result of hepatocellular apoptotic rate in mice detected by FCM(±s，n=10)

＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs model

Group Dose/mg·kg－1Apoptotic rate/%Control 0 1.43 ±0.44 Model 0 12.67 ±1.67＊＊NAC 155 2.28 ±0.33##F1013 5 2.94 ±0.99##2.5 3.15 ±0.76##1.25 3.77 ±0.59##

3 討論

1992年，Tiegs等［3］成功地應用 ConA 誘發了小鼠急性肝損傷。這一實驗模型是近年來新發展起來的由淋巴細胞介導的免疫性肝損傷，很好地模擬了人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病，是篩選急性肝炎和暴發性肝衰竭治療藥物較理想的動物模型。本研究在建立ConA誘導的小鼠急性肝損傷的基礎上，造模后2 h給予F1013治療，可明顯減輕肝臟病理損傷;明顯抑制ConA引起的肝損傷小鼠血清中ALT、AST和T-Bil水平的升高，說明F1013對ConA誘導的急性肝損傷小鼠具有明顯的治療作用。

TNF-α在ConA誘導的肝損傷中起主要介導作用。急性肝損傷時，血清 TNF-α 含量增高［4－6］，其既可通過促進炎癥的方式參與肝損傷，又可以通過死亡受體途徑激活凋亡程序［7］。TNF-α在通過死亡受體途徑激活凋亡程序的過程中，TNF-α先要作為配體與細胞膜上的相應受體結合，將凋亡信號傳導入細胞內，激活Caspase，最后導致細胞凋亡的發生。本實驗結果顯示給予F1013能明顯降低模型血清TNF-α水平，提示F1013對TNF-α的抑制作用是保護肝細胞的重要機制。

Con A誘導的肝炎模型中，Fas抗原表達增多［8］，肝組織中出現大量的凋亡細胞［9］，本實驗也發現，Con A可誘導小鼠肝細胞凋亡，給予F1013能明顯降低肝細胞凋亡率，其抗肝細胞凋亡作用與F1013廣譜抑制Caspase活性有關。

綜上所述，F1013對ConA誘導的急性肝損傷小鼠具有較好的治療作用，其抗急性肝損傷的機制可能與降低血清TNF-α水平和減少肝細胞凋亡有關，為臨床治療急性肝損傷提供新的思路。

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