8種生物殺菌劑對草莓枯萎病菌室內抑菌活性的測定

2014-11-15 13:25:50吉沐祥等

江蘇農業科學 2014年9期

吉沐祥等

摘要：為探明生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的室內抑菌活性，采用菌絲生長速率法測定了8種生物殺菌劑對草莓枯萎病的室內抑菌活性。結果表明，申嗪霉素、寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素、乙蒜素、氨基寡糖素、井岡霉素、春雷霉素對草莓枯萎病菌的EC50分別為0.790 2、5.256 9、6.911 0、10.855 5、27.623 2、29.558 4、29.976 1、35.584 1 μg/mL。草莓枯萎病菌對8種生物殺菌劑的敏感性差異較大，供試草莓枯萎病菌對申嗪霉素最敏感，其次為寡雄腐霉。

關鍵詞：草莓枯萎病菌；生物殺菌劑；抑菌活性

中圖分類號： S436.67+4文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0103-03

收稿日期：2014-06-15

基金項目：江蘇省科技支撐計劃（編號：BE2012378）；江蘇省“六大人才高峰”項目（編號：2013-NY-001）；江蘇省鎮江市農業科技支撐計劃（編號：NY2013014）。

作者簡介：吉沐祥（1963—），男，江蘇寶應人，研究員，主要從事植保農藥研究與開發。E-mail：jilvdun2800@163.com。

通信作者：李國平，研究員。E-mail：jrlgp@126.com。草莓（Fragaria ananassa Duch）以其果實柔軟多汁、味道鮮美、營養豐富、生育期短、結果早和產量高等特點備受人們喜愛，在國際市場上具有重要的經濟地位[1]。草莓枯萎病病原為尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum f.sp. fragariae），只危害草莓，是重要的土傳病害。該病導致草莓根系壞死，生長不良，矮小衰弱，葉無光澤，下部葉片變紫紅色萎蔫狀，葉柄和果梗的維管束變褐色或黑褐色，最后全株枯死。輕病株則結果減少，果實不能正常膨大，品質低劣。病菌在寄主病殘體內以菌絲體或厚垣孢子或擬菌核在土壤中越冬，或在病殘體、混有病殘體的堆肥、種子內外越冬，一般可存活6～8年，帶菌土壤是病害侵染的主要來源。環境條件適宜時，病菌借助帶病母株、土壤、水源、農具等進行傳播，從植株根部傷口或直接從幼根的表皮和根毛侵入，在植株維管束內繁殖，不斷擴散到植株葉及根系，引起植株系統性發病，最后干枯死亡。病菌喜溫暖潮濕環境，發病最適宜氣候條件為25～28 ℃，相對濕度60%～85%。草莓枯萎病的發病盛期在育苗中后期、假植期、定植初期。草莓枯萎病危害性大，是頑固性土傳病害，土壤通透性差、過干過濕、多年連作、氮肥過多或有線蟲危害的地塊易導致枯萎病的嚴重發生[2]。

目前，草莓枯萎病的防治有農業防治、物理防治、化學防治和生物防治等方法。農業防治包括作物輪作、移栽脫毒種苗、選育抗病品種以及高架基質栽培等，由于提高了勞動強度、生產成本，或因解除連作障礙的效果不佳等因素，還沒有在草莓種植中廣泛應用。物理防治方法主要是利用高溫土壤消毒技術，如袁會珠等采用室外小區試驗方法，在草莓栽培過程中利用客土法、人工基質法、太陽能土壤消毒方法防治草莓土傳病害，3種防治方法增產幅度分別高達100%、115%、129%，與溴甲烷土壤消毒差別不大，基本可以替代溴甲烷土壤消毒技術，但該類方法存在勞動強度大和嚴重環境污染問題[3]。隨著化學防治導致病原菌抗藥性、農藥殘留等問題日益加重，生態環境和食品安全受到威脅，因而環境友好型生物農藥是化學農藥的最佳替代產品。本研究采用菌絲生長速率法分別測定了8種生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的室內毒力，并進行了防治草莓枯萎病的室內盆栽試驗，以期為草莓枯萎病的防治和新型生物藥劑的研發提供技術依據。

1材料與方法

1.1培養基

馬鈴薯培養基（PDA）[4]，用于草莓枯萎病菌的分離、保存以及毒力測定。

1.2菌株

草莓枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae），采自鎮江市句容草莓園，由江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所現代農業研究室分離、鑒定，按照柯郝法則（Kochs rule）[5]驗證后保存備用。菌株保存于PDA斜面上（4 ℃）。

1.3藥劑

90%乙蒜素（ethylicin），開封大地農化生物科技有限公司生產；67.1%井岡霉素（Jinggangmycin），杭州正誠農化有限公司生產；65%春雷霉素（kasugamycin），華北制藥股份有限公司生產；95%申嗪霉素（phenazine-1-carboxylic acid），上海農樂生物制品股份有限公司生產；80%氨基寡糖素（oligosaccharins），濰坊華諾生物科技有限公司生產；3%超敏蛋白（harpin protein），江蘇省農墾生物化學有限公司生產；1.0×106個孢子/g寡雄腐霉（pythium oligandrum），捷克生物制劑有限公司生產；4%嘧啶核苷類抗菌素（pyrimidine nucleoside antibiotics），武漢科諾生物有限公司生產。

1.4儀器設備

電子天平（感量0.1 mg）、GZP-300A培養箱、直徑為 75 mm 的培養皿、三角瓶、移液器、移液管、洗耳球、打孔器、接種刀等。

1.5試驗方法

1.5.1藥液的配制及濃度設計母液配制：將90%乙蒜素和95%申嗪霉素分別用適量丙酮溶解并加入10%的吐溫-80，其他藥劑分別用適量無菌水溶解，各藥劑均配制成 1 000 μg/mL 的母液置于4 ℃冰箱中備用。

不同藥劑在含藥PDA培養基中的濃度設計均為：0.781 25～100.000 00 μg/mL，共8個梯度濃度（表1）。除母液外所有試驗藥劑系列濃度的藥液均為現配現用。

1.5.2敏感性檢測采用菌絲生長速率法[6]，將保留的草莓枯萎病菌轉接到PDA平皿中，在25 ℃下活化96 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉接到1.4倍比稀釋配制的含藥和空白對照的PDA平皿中，25 ℃培養96 h，待對照中菌落長至約平皿直徑的4/5時，采用十字交叉法量取菌落直徑。

計算菌落直徑均值，按照下列公式計算菌絲生長平均抑制率。菌絲生長平均抑制率=[（對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值）/（對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑）]×100%。采用DPS 13.0專業版數據處理系統，計算出各藥劑對草莓枯萎病菌菌絲生長抑制的回歸方程、EC50及其95%置信限，并以最敏感藥劑的EC50值為對照求出相對毒力指數。

2結果與分析

2.1不同生物殺菌劑對草莓枯萎病菌絲生長的影響

2.2草莓枯萎病菌對不同生物殺菌劑敏感性的比較

敏感性檢測結果表明，申嗪霉素、寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素、乙蒜素、氨基寡糖素、井岡霉素、春雷霉素對草莓枯萎病菌的EC50值分別為0.790 2、5.256 9、6.911 0、10855 5、27.623 2、29.558 4、29.976 1、35.584 1 μg/mL。8種供試生物殺菌劑中，申嗪霉素對草莓枯萎病菌菌絲生長的抑制活性最強，而春雷霉素的抑制活性最低，二者EC50值相差約34.7939 μg/mL。以申嗪霉素的EC50值為對照得出了不同殺菌劑相對毒力指數，寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素的相對毒力指數分別為6.65、8.75、13.74；乙蒜素、氨基寡糖素、井岡霉素、春雷霉素的相對毒力指數在34～46之間（表2）。表明我國自主開發的抗生素類生物殺菌劑——申嗪霉素對供試草莓枯萎病菌的抑制活性最強；寡雄腐霉、超敏蛋白、嘧啶核苷類抗菌素對草莓枯萎病菌的抑制活性較強；而井岡霉素和春雷霉素等生物殺菌劑對草莓枯萎病菌的抑制活性相對較弱。表2草莓枯萎病菌對8種生物殺菌劑的敏感性檢測結果

3結論與討論

草莓連作障礙問題、草莓枯萎病的防治一直以來都引起了各級植保部門的高度關注。由于草莓為多年生植物，在同塊地里連續多年種植后，致使土壤中病菌大量積累，加上品種抗病性下降、田間管理不善等影響因素，導致草莓枯萎病發病率逐年加重。目前，在抗草莓枯萎病品種缺乏的情況下，選擇適當藥劑并采用合適的施藥方法是防治草莓枯萎病的重要措施。生物防治是防治草莓土傳病害，解除草莓連作障礙技術研究的熱點。王占武等以拮抗細菌B501在草莓根際進行定植防治草莓黃萎病，連續2年的田間防效分別達到了939%、968%[7]。馬寶紅等利用VAM 菌根菌（Glomus mosseae 和Glomus versiforme），對草莓有促生、防黃萎病的效果[8]。馮玉龍等利用拮抗芽孢桿菌發酵液的硫酸銨沉淀物來防治草莓黃萎病[9]。徐淑華等利用2株拮抗細菌和多種植物提取物防治草莓黃萎病，并取得初步成效[10]。甄文超等利用藥用植物源土壤添加物控制草莓再植病害，針對草莓再植病害的3種主要病原菌：Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum和Verticillium dahliae篩選了125種藥用植物腐解物提取液具有抑菌活性，并證明川芎和苦參的等量混合物有望用于草莓黃萎病害的防治[11]。趙秀娟等從草莓根圍分離的拮抗細菌發酵液對草莓重茬病害有一定防效[12]。宋志偉等用1種復合微生物制劑對草莓黃萎病的田間防效達76.9%～846%[13]。Vosatka 等用AMF （Arbuscular micorrhizal fungi）和Pseudomonas putida同時接種草莓根際土壤發現，它們具有增效互作作用[14]；利用Agrobacterium radiobacter能夠促進AMF 在草莓根際定殖[15]。Porras等利用太陽能土壤消毒和木霉菌劑結合的方法，明確了在太陽高溫消毒后再添加生物菌劑的方法，2年防效達84.5%[16]。但在當前的草莓生產中，防治草莓枯萎病等土傳病害，仍缺乏高效穩定的生防制劑。

本研究采用菌絲生長速率法測定了草莓枯萎病菌對寡雄腐霉、嘧啶核苷類抗菌素、春雷霉素，井岡霉素、超敏蛋白、乙蒜素、申嗪霉素、氨基寡糖素8種生物殺菌劑的室內毒力。結果表明，8種生物殺菌劑的毒力大小順序為申嗪霉素>寡雄腐霉>超敏蛋白>嘧啶核苷類抗菌素>乙蒜素>氨基寡糖素>井岡霉素>春雷霉素。申嗪霉素為我國自主開發的抗生素類生物殺菌劑，是由熒光假單胞菌菌株M18經發酵、提取而成，對西瓜枯萎病、辣椒疫病等土傳病害有良好的防治效果[17]，本研究中申嗪霉素對草莓枯萎病菌菌絲生長的抑制活性最強，表明該藥劑具有較好的應用前景。本研究僅進行了殺菌劑的室內篩選，還有待于在田間開展藥劑防治試驗，同時還需進一步研究各類藥劑的應用技術，確保草莓的綠色無公害生產。

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