劉亞舉,張麗娟
(1.許昌市公安局刑事科學技術研究所,河南 許昌461000;2.長葛市公安局刑偵大隊,河南 長葛461500)
訴訟與案例
Litigation and Case Report
PrepFilerTM提取甲醛固定石蠟包埋組織檢測STR分型1例
劉亞舉1,張麗娟2
(1.許昌市公安局刑事科學技術研究所,河南 許昌461000;2.長葛市公安局刑偵大隊,河南 長葛461500)
法醫遺傳學;Prepfiler磁珠法;甲醛;石蠟包埋組織;STR分型
1.1 簡要案情
2004年7月某日下午,張某(女,25歲,小區內業主)與楊某(男,57歲,小區公用車棚門衛)因故吵架,楊某倒地后死亡。法醫病理檢驗顯示,楊某系冠狀動脈粥樣硬化性心臟病而死亡。死者家屬不服死因結論,多次上訪,8年后有關部門將死者心腎器官的石蠟包埋病理組織送至DNA實驗室要求檢驗鑒定。
1.2 檢驗過程及結果
取石蠟包埋組織適量,放入1.5mL的離心管中,加入生理鹽水800μL,漩渦震蕩30 s,65℃以900 r/min振搖保溫20min,12 000 r/min離心1min,棄上清,重復上面步驟2次。參照美國AB公司PrepFiler試劑盒手工操作步驟:(1)裂解:在該離心管內加入裂解液300μL和1M的DTT 3μL,漩渦震蕩5 s,離心10 s,70℃以900 r/min振搖保溫40min。(2)去除承載體:在新的1.5mL離心管中裝上LySepTM過濾柱,取上述裂解產物300μL于LySepTM過濾柱中,12 000 r/min離心1min,棄掉LySepTM過濾柱。(3)磁珠結合DNA:在上述濾液中加入混勻的磁珠懸液15μL,1000 r/min漩渦震蕩10s,離心10s;再加入異丙醇180μL,1000 r/min漩渦震蕩5 s,短暫離心;室溫以1000 r/min振搖結合10min。(4)洗滌:10000 r/min漩渦震蕩10s,離心10s,將離心管置于磁力架上,2min后吸去液體;加入洗滌液300μL,取下離心管,10000 r/min漩渦震蕩5 s,離心10 s,再置于磁力架上,50 s后吸去液體,重復該步驟2次;最后在磁力架上,打開管蓋,室溫干燥已結合DNA的磁珠8min。(5)洗脫DNA:加入洗脫液50μL,10 000 r/min漩渦震蕩5 s,離心10 s;70℃以900 r/min振搖保溫5min,10 000 r/min漩渦震蕩2 s,離心10 s;置于磁力架上,1min后吸取DNA溶液備用。
采用IdentifilerPlus試劑盒(美國AB公司)10μL體系,在9700型擴增儀(美國AB公司)上標準程序進行復合擴增,擴增產物在3500XL型遺傳分析儀(美國AB公司)上檢測,用GeneMapper ID-X軟件(美國AB公司)進行STR分型。結果顯示,PrepFiler磁珠法得到了完整STR分型,并且STR峰型尖銳清晰、平衡性好(見圖1),與死者血樣STR分型一致。

圖1 PrepFiler磁珠法甲醛固定石蠟包埋組織STR分型
甲醛固定石蠟包埋組織的DNA檢驗,既要盡量減少組織額外的損傷,又要保證組織中的DNA被釋放,最佳的方法應該是:無毒、快速、經濟且能回收到高純度的DNA,但是符合上述要求的“通用”方法不存在,那么就要建立有效的方法。主要的脫蠟方法有:(1)有機溶劑法:在二甲苯中浸泡脫蠟,但其有毒,而且操作過程復雜,容易引起外源性污染;(2)水浴加熱法:將石蠟包埋組織加入到生理鹽水或TES溶液(10mmol Tris-HCL、1mmol EDTA、0.5%SDS)中,65℃10min或56℃ 30min使石蠟溶解,加熱時間越長,DNA受損越嚴重,由于組織受熱不均,也會脫蠟不徹底。在本案中,考慮到組織比較有脆性,就選擇了簡單的脫蠟法,將包埋組織加入到生理鹽水中65℃保溫20min,為使組織受熱均勻脫蠟徹底,在保溫的過程中以900 rpm振搖離心管。
對于DNA提取方法的選擇,常用的是小體積Chelex100+PK法、QIAGEN硅膠模法、IQ磁珠法[1]和酚氯仿法、C-有-柱法(Chelex法后,經酚氯仿法濃縮,再過Microcon-100柱)[2]。不管何種方法,目的就是去除抑制劑、提高DNA大片段回收率,得到高純度的DNA模板。本案中,PrepFiler試劑盒使用的DNA提取與純化方法是關鍵,它采用高效的裂解液,在DTT協同下,將組織中的DNA充分釋放,同時含有DNA的裂解液能流過LySepTM柱專利濾膜,其它底物被保留在柱子上;而磁珠是多聚體修飾的復合化學物質包埋的磁性顆粒,粒徑小,均一程度高,表面積大、磁響應性好,膠質穩定性、重分散性好,不易沉淀,使DNA與磁性顆粒能完全地結合,經過特殊配方的洗滌液,最大程度地去除了抑制劑;經修飾的磁珠表面功能基團,偶聯得到的DNA產量和質量很高,并對DNA產量均一化,使用50μL洗脫體積,避免了后續STR小片段的優勢擴增,保證了STR復合擴增的均衡性。最后是STR擴增試劑盒的選擇,在本案中,使用的IDPlus試劑盒提高了抗PCR抑制能力、提高了擴增信號、減少了PCR偽峰,經29個循環,結果是STR分型完整,并且STR峰型尖銳清晰、平衡性好,與死者血樣STR分型一致。
[1]柳燕,李莉,趙珍敏,等.甲醛固定石蠟包埋組織STR分型檢測[J].法醫學雜志,2009,25(5):337-340.
[2]劉德衍,楊鋒,袁磊,等.甲醛固定石蠟包埋組織DNA提取方法比較[J].中國法醫學雜志,2011,26(6):465-467.
(本文編輯:李成濤)

司法部司法鑒定科學技術研究所2015年教學培訓計劃
DF795.4
B
10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.026
1671-2072-(2015)02-0123-02
2013-04-25
劉亞舉(1978—),男,主檢法醫師,主要從事法醫物證檢驗及鑒定工作。E-mail:horse3697@126.com。