劉亞舉，張麗娟

（1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 許昌461000；2.長(zhǎng)葛市公安局刑偵大隊(duì)，河南 長(zhǎng)葛461500）

訴訟與案例
Litigation and Case Report

PrepFilerTM提取甲醛固定石蠟包埋組織檢測(cè)STR分型1例

劉亞舉1，張麗娟2

（1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 許昌461000；2.長(zhǎng)葛市公安局刑偵大隊(duì)，河南 長(zhǎng)葛461500）

法醫(yī)遺傳學(xué)；Prepfiler磁珠法；甲醛；石蠟包埋組織；STR分型

1 案例

1.1 簡(jiǎn)要案情

2004年7月某日下午，張某（女，25歲，小區(qū)內(nèi)業(yè)主）與楊某（男，57歲，小區(qū)公用車(chē)棚門(mén)衛(wèi)）因故吵架，楊某倒地后死亡。法醫(yī)病理檢驗(yàn)顯示，楊某系冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病而死亡。死者家屬不服死因結(jié)論，多次上訪(fǎng)，8年后有關(guān)部門(mén)將死者心腎器官的石蠟包埋病理組織送至DNA實(shí)驗(yàn)室要求檢驗(yàn)鑒定。

1.2 檢驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果

取石蠟包埋組織適量，放入1.5mL的離心管中，加入生理鹽水800μL，漩渦震蕩30 s，65℃以900 r/min振搖保溫20min，12 000 r/min離心1min，棄上清，重復(fù)上面步驟2次。參照美國(guó)AB公司PrepFiler試劑盒手工操作步驟：（1）裂解：在該離心管內(nèi)加入裂解液300μL和1M的DTT 3μL，漩渦震蕩5 s，離心10 s，70℃以900 r/min振搖保溫40min。（2）去除承載體：在新的1.5mL離心管中裝上LySepTM過(guò)濾柱，取上述裂解產(chǎn)物300μL于LySepTM過(guò)濾柱中，12 000 r/min離心1min，棄掉LySepTM過(guò)濾柱。（3）磁珠結(jié)合DNA：在上述濾液中加入混勻的磁珠懸液15μL，1000 r/min漩渦震蕩10s，離心10s；再加入異丙醇180μL，1000 r/min漩渦震蕩5 s，短暫離心；室溫以1000 r/min振搖結(jié)合10min。（4）洗滌：10000 r/min漩渦震蕩10s，離心10s，將離心管置于磁力架上，2min后吸去液體；加入洗滌液300μL，取下離心管，10000 r/min漩渦震蕩5 s，離心10 s，再置于磁力架上，50 s后吸去液體，重復(fù)該步驟2次；最后在磁力架上，打開(kāi)管蓋，室溫干燥已結(jié)合DNA的磁珠8min。（5）洗脫DNA：加入洗脫液50μL，10 000 r/min漩渦震蕩5 s，離心10 s；70℃以900 r/min振搖保溫5min，10 000 r/min漩渦震蕩2 s，離心10 s；置于磁力架上，1min后吸取DNA溶液備用。

采用IdentifilerPlus試劑盒（美國(guó)AB公司）10μL體系，在9700型擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司）上標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在3500XL型遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）上檢測(cè)，用GeneMapper ID-X軟件（美國(guó)AB公司）進(jìn)行STR分型。結(jié)果顯示，PrepFiler磁珠法得到了完整STR分型，并且STR峰型尖銳清晰、平衡性好（見(jiàn)圖1），與死者血樣STR分型一致。

圖1 PrepFiler磁珠法甲醛固定石蠟包埋組織STR分型

2 討論

甲醛固定石蠟包埋組織的DNA檢驗(yàn)，既要盡量減少組織額外的損傷，又要保證組織中的DNA被釋放，最佳的方法應(yīng)該是：無(wú)毒、快速、經(jīng)濟(jì)且能回收到高純度的DNA，但是符合上述要求的“通用”方法不存在，那么就要建立有效的方法。主要的脫蠟方法有：（1）有機(jī)溶劑法：在二甲苯中浸泡脫蠟，但其有毒，而且操作過(guò)程復(fù)雜，容易引起外源性污染；（2）水浴加熱法：將石蠟包埋組織加入到生理鹽水或TES溶液（10mmol Tris-HCL、1mmol EDTA、0.5%SDS）中，65℃10min或56℃ 30min使石蠟溶解，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，DNA受損越嚴(yán)重，由于組織受熱不均，也會(huì)脫蠟不徹底。在本案中，考慮到組織比較有脆性，就選擇了簡(jiǎn)單的脫蠟法，將包埋組織加入到生理鹽水中65℃保溫20min，為使組織受熱均勻脫蠟徹底，在保溫的過(guò)程中以900 rpm振搖離心管。

對(duì)于DNA提取方法的選擇，常用的是小體積Chelex100+PK法、QIAGEN硅膠模法、IQ磁珠法[1]和酚氯仿法、C-有-柱法（Chelex法后，經(jīng)酚氯仿法濃縮，再過(guò)Microcon-100柱）[2]。不管何種方法，目的就是去除抑制劑、提高DNA大片段回收率，得到高純度的DNA模板。本案中，PrepFiler試劑盒使用的DNA提取與純化方法是關(guān)鍵，它采用高效的裂解液，在DTT協(xié)同下，將組織中的DNA充分釋放，同時(shí)含有DNA的裂解液能流過(guò)LySepTM柱專(zhuān)利濾膜，其它底物被保留在柱子上；而磁珠是多聚體修飾的復(fù)合化學(xué)物質(zhì)包埋的磁性顆粒，粒徑小，均一程度高，表面積大、磁響應(yīng)性好，膠質(zhì)穩(wěn)定性、重分散性好，不易沉淀，使DNA與磁性顆粒能完全地結(jié)合，經(jīng)過(guò)特殊配方的洗滌液，最大程度地去除了抑制劑；經(jīng)修飾的磁珠表面功能基團(tuán)，偶聯(lián)得到的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量很高，并對(duì)DNA產(chǎn)量均一化，使用50μL洗脫體積，避免了后續(xù)STR小片段的優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增，保證了STR復(fù)合擴(kuò)增的均衡性。最后是STR擴(kuò)增試劑盒的選擇，在本案中，使用的IDPlus試劑盒提高了抗PCR抑制能力、提高了擴(kuò)增信號(hào)、減少了PCR偽峰，經(jīng)29個(gè)循環(huán)，結(jié)果是STR分型完整，并且STR峰型尖銳清晰、平衡性好，與死者血樣STR分型一致。

[1]柳燕，李莉，趙珍敏，等.甲醛固定石蠟包埋組織STR分型檢測(cè)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2009，25（5）：337-340.

[2]劉德衍，楊鋒，袁磊，等.甲醛固定石蠟包埋組織DNA提取方法比較[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2011，26（6）：465-467.

（本文編輯：李成濤）

司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所2015年教學(xué)培訓(xùn)計(jì)劃

DF795.4

B

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.02.026

1671-2072-（2015）02-0123-02

2013-04-25

劉亞舉（1978—），男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證檢驗(yàn)及鑒定工作。E-mail：horse3697@126.com。