朱海峰 吳丹 吳敬

N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Mpr1）是能夠乙酰化脯氨酸類似物2-羧酸氮雜環(huán)丁烷（AZC）的一種胞內(nèi)酶［1］。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）∑1278b中的Mpr1可以使AZC乙酰化成N-acetyl AZC，從而防止AZC被誤認(rèn)為脯氨酸被生物體利用而產(chǎn)生毒性［2］。近年的研究發(fā)現(xiàn)Mpr1酶具有顯著的抗活性氧簇（ROS）氧化脅迫生理功能［2，6］。ROS是一類包含O2·、H2O2和·OH等的小分子物質(zhì)，是正常細(xì)胞的新陳代謝的副產(chǎn)物。ROS化學(xué)性質(zhì)極為活潑，積累后會給細(xì)胞造成極大的危害，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)發(fā)生解聚與降解［3］；還能同細(xì)胞器膜中不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞器功能受損［4］；嚴(yán)重時還能造成DNA的斷裂，引起細(xì)胞死亡［5］。在合成精氨酸途徑中Mpr1可直接將Δ1-吡咯啉-5-羧酸酯（P5C）或其平衡物谷氨酸-γ-半醛（GSA）乙酰化成N-乙酰GSA，從而減少了通常途徑中的多個轉(zhuǎn)化步驟，有利于精氨酸快速合成［6］，提高細(xì)胞抗ROS的性能。目前研究都集中在來源于S. cerevisiae∑1278b的 Mpr1 基因上［2］。

畢赤酵母（Pichia pastoris）是一種應(yīng)用極為廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，已表達(dá)了超過500多種異源蛋白質(zhì)［7］。由于P. pastoris代謝甲醇的生理特性，在利用甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的ROS而受到異常強(qiáng)烈的氧化脅迫。P. pastoris中一種N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（Mpr1）具有抗氧化脅迫功能，相關(guān)研究尚為空白。研究P. pastoris中的Mpr1抗氧化脅迫機(jī)制將有利于進(jìn)一步優(yōu)化P. pastoris細(xì)胞表達(dá)功能。本研究將來源于P. pastoris GS115的Mpr1基因在E. coli JM109進(jìn)行重組表達(dá)，并利用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵過程中的誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度、起始誘導(dǎo)OD進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳產(chǎn)酶條件；另外，對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步研究；同時分析Mpr1對原核細(xì)胞的生長影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 P. pastoris GS115、E. coli JM109均由本實驗室保藏，PQE30質(zhì)粒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：分子級蛋白胨5，酵母粉5，NaCl 10。

TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.34。

1.1.3 酶及其它試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I、Sac I，T4 DNA連接酶、Taq酶及其配套產(chǎn)品、膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒，E. coli感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，酵母基因組提取試劑盒購于大連寶生物公司。DTNB、酵母無氨基基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基購自上海生工。AZC、乙酰輔酶A購自Sigma。蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量以及SDS-PAGE試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。其它常規(guī)試劑購自國藥集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 Mpr1基因的PCR擴(kuò)增 P. pastoris GS115基因組按照上海生工基因組提取試劑盒操作步驟提取。根據(jù)NCBI網(wǎng)站Mpr1基因序列（登錄號：GENban XP_002492064.1）設(shè)計引物如下：P1（正向引物）5'-GACGGATCCATGAGTTCTACTCTAGATCCTGA AC-3'；P2（反向引物）5'-AACGAGCTCTTAAGAAA GGTCCGTATCGCATGT-3'，下劃線分別表示BamH I和Sac I酶切位點，以引物P1、P2對P. pastoris GS115基因組PCR擴(kuò)增獲得Mpr1基因片段。PCR反應(yīng)體系 50μL ：G+C buffer 10μL，ddH2O 33.5μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5μL， 基 因 組 1μL，正向引物 0.5μL，反向引物 0.5μL，dNTP 4μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；98℃變性10s，55℃退火5s，72℃延伸90s，30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保溫。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測目的產(chǎn)物。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 使用膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，于16℃與pMD18-T載體連接過夜后，轉(zhuǎn)入E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單克隆菌落于液體LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)8h左右，抽提質(zhì)粒，酶切驗證后并進(jìn)行基因測序。測序正確后將pMD18-T-Mpr1經(jīng)BamH I、Sac I雙酶切之后，將片段純化、回收，質(zhì)粒PQE30也以同樣的方法酶切并膠回收。T4 ligase連接目的基因和載體，過夜后轉(zhuǎn)入E.coli JM109的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有100μg/mL Amp抗性濃度的LB平板，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h左右，抽提質(zhì)粒，酶切驗證并測序，得到正確的表達(dá)載體命名為PQE30-Mpr1，獲得重組菌命名為PQE30-Mpr1-E.coli JM109。

1.2.3 Mpr1酶基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的重組菌PQE30-Mpr1-E.coli JM109接種到含有Amp的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h后轉(zhuǎn)接到含Amp的TB培養(yǎng)基，在37℃ 200r/min生長至設(shè)定OD后加入IPTG在不同的溫度下誘導(dǎo)表達(dá)。發(fā)酵后12000r/min離心5min收集菌體，用Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH7.5）懸浮菌體，超生破碎菌體，12000r/min離心5min后上清即為重組Mpr1酶的粗酶液。

1.2.4 N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 Mpr1 酶活測定［8］在 30℃條件下將1mL反應(yīng)液在412nm下測定光吸收的變化。其中TNB的消光系數(shù)為15 570 M-1·cm-1。一個酶活力單位定義為在1min內(nèi)形成1μmol TNB的量，具體成分包括：Tris-HCl buffer（pH7.5）50mmol/L，800μL ；AZC 5mmol/L，50μL ；acetyl-CoA 0.2mmol/L，50μL ；DTNB 1mmol/L，50μL ；酶 液50μL。

反應(yīng)計算公式：A = ε b c

其中，ε=15 570 M-1·cm-1，A為吸光度，b為測定物質(zhì)濃度M（mol/L），c為液層厚度（cm）。

通過測定1min內(nèi)A的變化算出b的濃度的生成量，計算出酶活。

1.2.5 E. coli細(xì)胞內(nèi)ROS含量測定 用配制的磷酸鈉緩沖溶液將離心的發(fā)酵液樣品稀釋為菌液OD600約0.2（細(xì)胞濃度1×107cells/mL）的懸浮液，取1mL菌液加入5μL DCFH-DA溶液，在37℃、50r/min水浴搖床內(nèi)避光負(fù)載30min，然后將樣品放在冰上避光保藏［9］。對照樣品加入5μL不含DCFH-DA的DMSO，相同條件下處理；用流式細(xì)胞技術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 Box及其合作者于20世紀(jì)50年代提出的響應(yīng)面分析法（Response Surface Analysis）被廣泛應(yīng)用于食品、化工、農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域［10，11］。本研究根據(jù)正交實驗結(jié)果選取3個主要因素進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，并用SAS 8.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，通過微分方法預(yù)測實驗最佳點。

1.2.7 重組Mpr1酶最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性分析

1.2.7.1 Mpr1酶最適反應(yīng)pH 將純化獲得酶液離心處理，用不同pH值的緩沖液復(fù)溶，在30℃下測定重組Mpr1酶活力，將最高的Mpr1酶活為定義為100％，并計算其它樣品的相對活力。

1.2.7.2 Mpr1酶的pH穩(wěn)定性 將離心處理的酶用pH 分 別 為 3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0的50mmol/L緩沖液復(fù)溶，于4℃放置24h，測定其酶活力。

1.2.8 重組Mpr1酶最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性分析

1.2.8.1 Mpr1酶的最適反應(yīng)溫度 將酶反應(yīng)體系分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和60℃等溫度下測定酶活力，將最高酶活定義為100％，并計算各樣品的相對活力。

1.2.8.2 Mpr1酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分別在4℃、10℃、20℃、30℃和40℃等不同梯度溫度條件下水浴保溫，每隔1h取一次樣，測定殘留酶活。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的的構(gòu)建

提 取P. pastoris GS115基 因 組DNA，PCR擴(kuò)增得到基因Mpr1（圖1），將得到cDNA克隆到pMD18-T simple vector。測序結(jié)果表明，MPR基因全長627bp，編碼208個氨基酸，與NCBI網(wǎng)站報道的登錄號為GENban XP_002492064.1的P. pastoris GS115的Mpr1編碼的蛋白序列完全一致。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

將pMD18-T simple vector和表達(dá)載體PQE30分別進(jìn)行BamH I、Sac I雙酶切之后，膠回收、連接、轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取單克隆培養(yǎng)過夜后，抽提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切得到大小約為3 460bp和627bp的DNA片段（圖2），獲得的重組質(zhì)粒PQE30-Mpr1，獲得重組菌命名為PQE30-Mpr1-E.coli JM109。

圖2 重組質(zhì)粒PQE30-Mpr1酶切電泳驗證

將重組菌PQE30-Mpr1-E.coli JM109接種到含Amp的LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接TB培養(yǎng)基誘導(dǎo)24h后破壁胞內(nèi)上清酶活為462 mU/mL，攜帶空載體的對照菌PQE30-E.coli JM109未檢測到酶活。SDS-PAGE（圖3）顯示，23kD處有可溶性目的蛋白條帶。

圖3 重組菌發(fā)酵產(chǎn)Mpr1酶SDS-PAGE圖

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化重組菌株發(fā)酵條件

根據(jù)Box-Bchnken的中心組合設(shè)計原理［10］，設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，共有15個試驗點，以發(fā)酵溫度，IPTG含量和誘導(dǎo)起始OD為自變量，以發(fā)酵液酶活為響應(yīng)值，實驗因素與水平的選取，見表1。

表1 因素與水平取值表

15個實驗點可分為兩類：一是析因點，自變量取值在x1，x2，x3所構(gòu)成的三維頂點，共12個析因點；二是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)3次，以估計實驗誤差，每次實驗得到的酶活，見表2。

以發(fā)酵液酶活產(chǎn)量為響應(yīng)值，運用SAS程序進(jìn)行回歸擬合后，各實驗因子對響應(yīng)值的影響可用下列函數(shù)表示：Y1=604.67-38.13X1+7.12X2+7.75X3-2.75X1X2-0.5X1X3+1X2X3--32.21X32。運用SAS程序?qū)貧w方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表3）顯示，所做模型和3個因素的“Prob＞F”值遠(yuǎn)小于0.05，說明所做的回歸方程模型及3個影響因素的結(jié)果是顯著的。根據(jù)R2=0.983 7能解釋98.37％的發(fā)酵酶活變化水平。因此回歸方程為重組E. coli發(fā)酵產(chǎn)Mpr1酶提供了一個適合的模型。計算得到的RSA（圖4）顯示，在3種因素中對發(fā)酵酶活影響由大到小分別是誘導(dǎo)溫度＞IPTG濃度＞起始誘導(dǎo)生物量，說明溫度是影響重組E. coli誘導(dǎo)產(chǎn)酶最關(guān)鍵因素。經(jīng)RSA擬合后可看到擬合模型具有真實的最大值。

表2 響應(yīng)面分析實驗安排與發(fā)酵酶活產(chǎn)量

表3 回歸方程的方差分析

經(jīng)過模型計算預(yù)測得到最大發(fā)酵酶活產(chǎn)量為611.7，其中3個因素的最佳值分別是誘導(dǎo)溫度在30℃，起始誘導(dǎo)生物量OD為4.5，IPTG濃度控制在0.4mmol/mL。為了證實預(yù)測的結(jié)果，用以上得到的最優(yōu)配方重復(fù)實驗3次，平均發(fā)酵酶活為（610.3±9.5）mU/mL，與預(yù)測值611.7良好的擬合性證實了模型的有效性，回歸方程為搖瓶發(fā)酵產(chǎn)Mpr1酶提供了一個合適的模型。

圖4 重組Mpr1酶活與誘導(dǎo)溫度（A）、起始誘導(dǎo)生物量（B）和IPTG濃度（C）的關(guān)系

2.3 重組Mpr1酶酶學(xué)性質(zhì)初步研究

將細(xì)胞高壓破碎后離心收集上清液，通過硫酸銨沉淀、透析、DEAE陰離子交換層析獲得純化的Mpr1酶，進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)初步研究。

2.3.1 重組Mpr1酶的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

重組Mpr1酶反應(yīng)的最適pH的研究結(jié)果（圖5-A）顯示，pH在7-7.5酶活性最高。考察重組Mpr1酶的pH穩(wěn)定性，將其置于pH3.0-9.0的緩沖體系中4℃保溫24h后，測定殘留酶活。結(jié)果（圖5-B）顯示，重組Mpr1酶的pH穩(wěn)定范圍為6.5-8.0，在此范圍內(nèi)保溫24h，重組Mpr1酶活約保持在90％以上，在pH4.0-6.5范圍內(nèi)保溫24h，酶活可保持在50％以上，而當(dāng)pH＞8.0和pH＜4.0時，Mpr1酶穩(wěn)定性很差。

2.3.2 重組Mpr1酶的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性在不同溫度條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定Mpr1酶酶活力。結(jié)果（圖6-A）顯示，重組Mpr1酶在30℃時酶活最高，而當(dāng)溫度繼續(xù)上升后，Mpr1酶活力逐漸下降，可能是由于高溫造成了酶蛋白逐漸變性。將重組Mpr1酶分別在不同溫度條件下水浴保溫，考察其熱穩(wěn)定性。結(jié)果（圖6-B）顯示，重組Mpr1酶在4-20℃之間，保溫3h Mpr1酶的表現(xiàn)相對穩(wěn)定，在30℃保溫3h，酶活殘留50％左右，而在40℃下保溫2h剩余活性不足40％，表明重組Mpr1酶在低溫條件下具有較好的穩(wěn)定性。

圖5 Mpr1酶反應(yīng)的最適pH（A）和pH穩(wěn)定性（B）

2.4 表達(dá)Mpr1對E.coli JM109生長影響的初步研究

Momura等［12］在研究來源于 S. cerevisiae細(xì)胞∑1278b和粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶時，發(fā)現(xiàn)將上述來源的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在重組E. coli中實現(xiàn)異源表達(dá)后，重組E.coli同時還具有了抗AZC的活性。在利用重組E.coli胞內(nèi)表達(dá)P. pastoris來源Mpr1時發(fā)現(xiàn)重組菌的生長狀況要好于對照菌（圖7），在發(fā)酵24h后重組菌的細(xì)胞OD達(dá)到14左右，而對照菌OD僅為9。基于Mpr1具有顯著的抗氧化脅迫的功能，又測定了E. coli胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)重組菌胞內(nèi)ROS含量顯著低于對照菌。這可能是重組E. coli表達(dá)Mpr1時，Mpr1酶使其抗氧化脅迫能力得到增強(qiáng)，從而改善細(xì)胞生長環(huán)境，因而生長速度明顯高于對照組。

圖6 Mpr1酶的最適反應(yīng)溫度（A）和熱穩(wěn)定性（B）

圖7 PQE30-E.coli JM109菌株和PQE30-Mpr1-E.coli JM109菌株細(xì)胞生長情況比較

表4 PQE30-E.coli JM109菌株和PQE30-Mpr1-E.coli JM109菌株細(xì)胞內(nèi)ROS含量分析

3 討論

目前國外研究報道均集中于S. cerevisiae的Mpr1。P. pastoris應(yīng)用廣泛，但是其在誘導(dǎo)的過程中受到的氧化脅迫嚴(yán)重影響其外源蛋白的表達(dá)性能，有關(guān)P. pastoris MPR1基因的研究目前尚屬空白。由于MPR1基因較為廣泛的分布于生物細(xì)胞中［13］，而所有的生物細(xì)胞都會受到ROS的影響，因此研究MPR1的表達(dá)調(diào)控也是抗氧化脅迫機(jī)制的共性問題之一。但是，畢赤酵母Mpr1在酵母內(nèi)表達(dá)量很低，無法滿足研究的需求，需要通過基因工程手段提高M(jìn)pr1酶的表達(dá)量。本實驗在E.coli JM109中成功實現(xiàn)胞內(nèi)表達(dá)來源于P. pastoris GS115的Mpr1酶。通過研究酶學(xué)性質(zhì)，P. pastoris Mpr1和S. cerevisiae Mpr1相比較具有較大區(qū)別。Michiyo等［12］研究同樣在E. coli中表達(dá)的S. cerevisiae細(xì)胞∑1278b中Mpr1酶時，發(fā)現(xiàn)其最適反應(yīng)pH范圍在8.5-9.0。可見來源于P. pastoris的Mpr1酶更適合于在偏中性的環(huán)境下發(fā)揮酶功能。Iinoya等［8］發(fā)現(xiàn)S. cerevisiae Mpr1酶在50℃條件下半衰期為8.2min，相比之下本研究中P. pastoris Mpr1在40℃下半衰期為1h左右，可見P.pastoris來源Mpr1較S. cerevisiae來源的Mpr1更加穩(wěn)定。經(jīng)NCBI網(wǎng)站blast比對分析發(fā)現(xiàn)，兩種同工酶的同源性僅為47％。鑒于P. pastoris具有極強(qiáng)的抗氧化脅迫能力，其Mpr1酶可能在抗氧化脅功能上存在特殊性，或者還存在有不同的生理功能，需要進(jìn)一步實驗來明確P. pastoris中Mpr1的生理功能。

為了獲得Mpr1酶的最佳發(fā)酵條件，采用RSA方法分別從誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度、起始誘導(dǎo)OD進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，最終酶活達(dá)到（610.3±9.5）mU/mL。優(yōu)化發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度對發(fā)酵水平的影響最大，其次是IPTG濃度和起始誘導(dǎo)OD。由于在利用E.coli異源表達(dá)時溫度越高，蛋白表達(dá)越容易形成包涵體，因而發(fā)酵溫度是影響蛋白表達(dá)的重要因素。較低發(fā)酵溫度有利于細(xì)胞控制自身的合成蛋白質(zhì)的速率，從而表達(dá)更多具有正常生理功能的蛋白質(zhì)。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)PQE30-Mpr1-E.coli JM109菌株的生長情況顯著好于PQE30-E.coli JM109菌株，經(jīng)分析各自胞內(nèi)ROS 水平，認(rèn)為是重組菌中所表達(dá)的Mpr1使其獲得更高的抗氧化脅迫能力，從而具有更強(qiáng)的生長能力。鑒于P. pastoris的生理特殊性，后續(xù)研究可通過構(gòu)建酵母Mpr1缺失突變體和過表達(dá)突變體，研究Mpr1在P. pastoris中的抗氧化脅迫調(diào)控規(guī)律，在分子水平闡明其抗ROS氧化脅迫的調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

構(gòu)建了重組菌PQE30-Mpr1-E.coli JM109，采用RSA方法從誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度、起始誘導(dǎo)OD分別對其進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，獲得最佳誘導(dǎo)發(fā)酵條件為：30℃，起始誘導(dǎo)OD=4.5，0.4mmol IPTG誘導(dǎo)24h后，Mpr1酶活達(dá)到（610.3±9.5）mU/mL。酶學(xué)性質(zhì)初步研究結(jié)果表明，Mpr1酶的最適反應(yīng)pH范圍為7.0-7.5，最適反應(yīng)溫度是30℃。此外，對比重組菌和對照菌在同樣條件下培養(yǎng)，重組菌生物量顯著高于對照菌，胞內(nèi)ROS含量較低，說明將Mpr1酶在E.coli JM109中表達(dá)之后，提高了其抗ROS脅迫能力，促進(jìn)了細(xì)胞的生長。

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