鐘 武，楊 帆

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，四川瀘州 646000）

氧化應(yīng)激對靜脈性潰瘍SDF-1α/CXCR4時(shí)相性表達(dá)的影響

鐘 武，楊 帆

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，四川瀘州 646000）

目的：探討靜脈性潰瘍組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)對SDF-1α/CXCR4表達(dá)時(shí)相的影響。方法：56例靜脈性潰瘍患者的潰瘍創(chuàng)面標(biāo)本，其中男性40例，女性16例，按病程分為：2周組；3周組；4周組；5周組，以正常皮膚56例作為對照組,測定氧化應(yīng)激產(chǎn)物丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）。Western blot檢測各組潰瘍創(chuàng)面SDF-1α、CXCR4表達(dá)趨勢，結(jié)果用灰度值分析；用免疫熒光雙染色檢測SDF-1α/CD31在潰瘍組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：發(fā)病3周后，靜脈性潰瘍組織MDA含量較正常皮膚組明顯升高（P＜0.05），GSH含量則明顯降低（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示靜脈性潰瘍SDF-1α、CXCR4變化趨勢一致，與正常皮膚組比較，病程＞3周各組表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），氧化應(yīng)激產(chǎn)物變化與SDF-1α、CXCR4表達(dá)聯(lián)系密切。經(jīng)免疫熒光雙染色顯示，發(fā)病3周后，靜脈性潰瘍組織中SDF-1α、CD31的表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：靜脈性潰瘍創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)，引起SDF-1α/CXCR4表達(dá)下調(diào)，可能與靜脈性潰瘍修復(fù)障礙有關(guān)。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α；趨化因子受體4；靜脈性潰瘍；氧化應(yīng)激

靜脈性潰瘍繼發(fā)于下肢靜脈功能不全[1]（chronic venous insufficiency，CVI），治療效果較差[2]。目前，靜脈性潰瘍發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但已有研究表明氧化應(yīng)激是靜脈性潰瘍繼發(fā)血管新生障礙中的重要環(huán)節(jié)[3]，而基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell derived factor-1α，SDF-1α）及CXC趨化因子受體4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）組成的生物軸能在缺血缺氧組織中高表達(dá)[4]，并且氧化應(yīng)激產(chǎn)物能促進(jìn)SDF-1α/CXCR4趨化陽性表達(dá)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向損傷部位募集[5]，使其在多種組織的再生過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。但是靜脈性潰瘍組織中氧化應(yīng)激與SDF-1α/CXCR4表達(dá)變化的內(nèi)在聯(lián)系尚不清楚，本研究通過觀察氧化應(yīng)激狀態(tài)下SDF-1α/CXCR4表達(dá)的時(shí)相性變化，探討氧化應(yīng)激對靜脈性潰瘍修復(fù)的影響機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 一般資料與分組

采集我院2014年1月至2015年1月收治的56例靜脈性潰瘍患者下肢潰瘍創(chuàng)面標(biāo)本，其中男性40例，女性16例，平均年齡（55.37±4.22）歲，按潰瘍病程分為：2周組；3周組；4周組；5周組。每組14人。取材要求：切除與正常皮膚交界處潰瘍組織，約0.3 cm×0.3 cm大小，以檢測氧化應(yīng)激對潰瘍修復(fù)的影響。取下肢淺表良性腫瘤梭形切除時(shí)的正常皮膚56例作為對照組，平均年齡（56.48±4.37）歲，取材前排除血管性疾病、糖尿病等。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

谷胱甘肽（GSH）試劑盒，丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成公司），小鼠SDF-1α單克隆抗體（abcom，英國），小鼠多克隆二抗（abcom，英國），兔CXCR4多隆抗體（abcom，英國），兔多克隆二抗（abcom，英國），小鼠CD31多克隆抗體（GenTex，美國），小鼠多克隆二抗（GenTex，美國），小鼠GAPDH單克隆抗體（abcom，英國），BZI-9000熒光顯微鏡 （日本），LAS400顯像系統(tǒng)（日本）。

1.3 MDA、GSH檢測

取正常皮膚、靜脈性潰瘍新鮮組織后，碾磨成組織勻漿，用MDA檢測試劑盒，硫代巴比妥酸法測定標(biāo)本中的MDA含量；比色法定量測定GSH含量。

1.4 Western blot檢測

RIPA提取組織蛋白，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉 2 h分別滴加一抗SDF-1α（1∶1 000）、CXCR4（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日，洗膜后滴加相應(yīng)小鼠多克隆二抗（1∶2 000），兔多克隆二抗（1∶2 000）。室溫孵育1 h用LAS400顯像系統(tǒng)觀察顯影，成像后采用IMAGE J2X軟件測定條帶灰度值行半定量分析。

1.5 免疫熒光雙染色

每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切5 μm厚切片，經(jīng)固定、通透后山羊血清室溫封閉30 min，分別滴加兔CXCR4多隆抗體（1∶100）、小鼠CD31多克隆抗體（1∶100），避光孵育 1 h后，加入對應(yīng)兔多克隆二抗（1∶200），小鼠多克隆二抗（1∶200）；熒光顯微鏡下觀察、采集圖像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同類型潰瘍MDA、GSH的濃度檢測。

在532 nm和 420 nm分別測定正常皮膚組和潰瘍組MDA、GSH的吸光度，經(jīng)公式計(jì)算正常皮膚組MDA的含量為（0.41±0.33）nmol∕mL，GSH的含量為（8.52±1.91）nmol∕mL；MDA、GSH濃度在靜脈性潰瘍病程三周開始明顯高于正常皮膚組，且時(shí)間越長，升高越明顯，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05，見表1）。

表1 各組潰瘍MDA、GSH含量比較（nmol∕mL,）

表1 各組潰瘍MDA、GSH含量比較（nmol∕mL,）

注：a表示與皮膚對照組、靜脈性潰瘍2 W組比較，P＜0.05；b表示與靜脈性潰瘍3 W組比較，P＜0.05；c表示與靜脈性潰瘍4 W組比較，P＜0.05

組別正常皮膚組靜脈性潰瘍2 W組靜脈性潰瘍3 W組靜脈性潰瘍4 W組靜脈性潰瘍5 W組n 56 14 14 14 14 F P MDA（nmol∕mL）0.41±0.33 0.56±0.54 2.55±0.41a5.69±0.41ab8.86±0.46abc5.391＜0.05 GSH（mg∕L）8.52±1.91 7.94±1.17 5.60±1.02a2.88±0.71ab1.13±0.62abc6.332＜0.05

2.2 SDF-1α/CXCR4在潰瘍組織中的表達(dá)

通過Western blot檢測，靜脈性潰瘍組中發(fā)病3周后SDF-1α、CXCR4表達(dá)明顯升高，但4周后，隨著MDA濃度持續(xù)升高，SDF-1α、CXCR4含量逐漸下降，直至 5周時(shí)已降至正常水平，灰度值分析顯示，靜脈性潰瘍病程2周、3周組與正常皮膚比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A、1B。病程 4周、5周組與病程2周、3周組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A、1C。

圖1 各組靜脈性潰瘍SDF-1α、CXCR4表達(dá)的時(shí)相性變化

2.3 SDF-1α、CD31免疫熒光雙染色

SDF-1α、CD31雙染色，結(jié)果示：靜脈性潰瘍早期（2～3周），SDF-1α、CD31表達(dá)上調(diào)，病程4周、5周組SDF-1α、CD31表達(dá)顯著降低，在某些區(qū)域出現(xiàn)點(diǎn)狀融合，共同表達(dá)于潰瘍組織中（圖2）。

圖2 免疫熒光雙染色檢測靜脈性潰瘍各個(gè)病程組SDF-1α/CD31表達(dá)相關(guān)性（×400）

3 討論

氧化應(yīng)激在調(diào)控細(xì)胞凋亡、增殖、衰老和分化過程中起著關(guān)鍵作用[6]。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物—丙二醛可反映潰瘍組織過氧化程度[7]，GSH參與清除ROS防護(hù)氧化應(yīng)激對機(jī)體產(chǎn)生的損傷[8]。其含量可在一定程度上反映機(jī)體的抗氧化能力[8-9]。目前人類已知的趨化因子達(dá)40多種，SDF-1α屬于CXC類，它可以激活其特異性受體CXCR4，在缺血、缺氧的環(huán)境下表達(dá)增強(qiáng)[10]，促進(jìn)血管新生[11]，CXCR4會誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞在SDF-1α/CXCR4生物軸的調(diào)控下向損傷部位遷移，提高損傷修復(fù)功能[12]。SDF-1α/CXCR4通路還參與骨髓中性粒細(xì)胞動員[13]，與組織損傷后中性粒細(xì)胞向損傷部位的遷移密切相關(guān)[14]。目前已證實(shí)，SDF-1α/CXCR4生物軸這種募集細(xì)胞促進(jìn)損傷修復(fù)的過程在骨、肌肉等多種組織器官損傷修復(fù)中有極大的調(diào)控潛力[15]。

對于靜脈性潰瘍，其再生修復(fù)過程需要穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，充足的血供和前體細(xì)胞以及多種活性因子協(xié)同參與[16]，在潰瘍組織中，氧化應(yīng)激一方面可直接介導(dǎo)組織損傷，另一方面活性氧自由基可抑制組織促修復(fù)因子（SDF-1、FGF、EGF、TGF-β等）向損傷部位遷移[17]，臨床上表現(xiàn)為創(chuàng)面遷延不愈。本研究針對氧化應(yīng)激與SDF-1α/CXCR4的內(nèi)在聯(lián)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在靜脈性潰瘍創(chuàng)面SDF-1α、CXCR4與MDA、GSH出現(xiàn)明顯變化是從病程3周開始，隨著MDA濃度持續(xù)升高，GSH含量不足以抑制局部氧化作用，3周后潰瘍SDF-1α、CXCR4表達(dá)隨即受到明顯抑制，病程5周時(shí)已降至正常水平，CXCR4變化趨勢與SDF-1α一致，氧化應(yīng)激導(dǎo)致局部SDF-1α/CXCR4的量相對不足。同樣，病程3周后CD31、CXCR4表達(dá)下降，與Western blot檢測SDF-1α、CXCR4的時(shí)相變化一致，結(jié)合分析MDA、GSH變化趨勢表明氧化應(yīng)激明顯抑制潰瘍局部血管新生。以上結(jié)果說明，病程前3周可能是靜脈性潰瘍病情演變的時(shí)間窗。

研究表明：靜脈性潰瘍創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)，抗氧化能力減弱，抑制SDF-1α/CXCR4生物軸對損傷組織的修復(fù)功能，阻礙血管新生，加重局部缺血缺氧程度，如果爭取在SDF-1α/CXCR4變化時(shí)間窗內(nèi)（發(fā)病3周內(nèi)）進(jìn)行抗氧化應(yīng)激相關(guān)治療，有望成為此類疾病新的治療方向。

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（2016-01-20收稿）

Effect of oxidative stress on the expression of SDF-1琢/CXCR4 in venous ulcer

Zhong Wu，Yang Fan
Department of Emergency Medicine，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Luzhou 646000,Sichuan Province,China

Objective：To investigate the effect of oxidative stress on the expression of SDF-1α/CXCR4 in venous ulcer.Methods：Ulcer samples were obtained from 56 patients including 40 males and 16 females with lower extremity venous ulcer treated.The ulcer samples were divided into 2,3,4,and 5 weeks groups based on the duration of the disease,and normal skin samples from 56 patients were used as controls.The oxidative stress products,MDA and GSH were analyzed.The expression of SDF-1α and CXCR4 was analyzed by western blot followed by densitometry analysis,and the colocalization ofSDF-1α and CD31 wasevaluated by immunofluorescence double staining.Results:After 3 weeks the concentration of MDA increased,whereas that of GSH decreased significantly（P＜0.05）respe-ctively compared to controls.The expression of both SDF-1α and CXCR4 was gradually decreased,which became significant（P＜0.05）after 3 weeks compared with that in the control groups.Immunofluorescence double staining revealed that the level of SDF-1α and CD31 was also markedly decreased in the venous ulcer group after 3 weeks compared with those in the control group,SDF-1α and CD31 colocalization was observed.Conclusion：The decreased expression of SDF-1α/CXCR4 induced by oxidative stress is possibly associated with the pathogenesis of venous ulcer.

Stromal cell derived factor-1α；Chemokine recceptor 4；Venous ulcer；Oxidative stress

R654.4

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.02.004

鐘 武（1973-），男，主任醫(yī)師，教授。E-mail：zhongwu2876@sina.com