劉璨穎，張濟培，王丙云

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大腸桿菌O-抗原血清型鑒定研究進展

劉璨穎，張濟培，王丙云

大腸桿菌在一定條件下能引發(fā)宿主疾病，其表面O-抗原與毒力有關(guān)。O-抗原的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)具有高度多樣性，并且O-抗原血清型種類與大腸桿菌致病性有一定聯(lián)系。因此，大腸桿菌O-抗原血清型鑒定對流行病學(xué)調(diào)查，防御和控制致病性大腸桿菌病有重要意義。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法耗時長、費用高、準確度不理想。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究者對大腸桿菌196種O-抗原基因簇進行了破譯，比較分析了不同O-抗原基因簇序列，并針對基因簇中特異性DNA序列設(shè)計分子標記，運用PCR方法對O-抗原血清型進行分型，其中包括一般PCR、多重PCR、實時PCR、DNA芯片和微球懸浮列陣法。此外，還有rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法，磁性微球免疫分析法和基于全基因組序列預(yù)測法，這些方法豐富了O-抗原血清型鑒定方法，彌補了傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法的不足。本文概述了O-抗原合成基因簇序列和O-抗原血清型鑒定方法相關(guān)研究進展。

大腸桿菌；O-抗原；血清型分型

大腸桿菌廣泛存在于自然界中，致病性大腸桿菌是一類重要的人獸共患病病原菌，依據(jù)致病特性分為腸內(nèi)致病性和腸外致病性大腸桿菌。腸內(nèi)致病性大腸桿菌能分泌毒素，引發(fā)宿主水樣、血樣腹瀉，甚至導(dǎo)致全身性臨床癥狀，如溶血尿毒癥和腎神經(jīng)后遺癥。腸外致病性大腸桿菌能侵襲并定殖于宿主胃腸道外組織，并誘發(fā)感染，包括腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染等。大腸桿菌菌株間差異大，常按照種系發(fā)育群、生物表型、致病特性、抗原特性等進行分類區(qū)分[1-2]。

菌體O-抗原，表面K-抗原和鞭毛H-抗原是大腸桿菌分型的主要表面抗原[3]。O-抗原是大腸桿菌脂多糖的最外層結(jié)構(gòu)，與細菌對環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)，是細菌的毒力因子，也是細菌噬菌體和宿主免疫系統(tǒng)的主要目標，能在宿主體內(nèi)誘發(fā)強烈的免疫反應(yīng)[4-6]。?rskov于1977年提出了綜合分型方案，將大腸桿菌O-抗原分為164種，該方案是分類學(xué)、流行病學(xué)調(diào)查、疾病暴發(fā)時菌株區(qū)分以及監(jiān)控中大腸桿菌分型的主要標準[7]。隨著研究成果的不斷更新，報道有O1-O187血清型，其中6種O-抗原血清型O31、O47、O67、O72、O94和O122被撤消，4種被分為亞型O18ab/ac，O28ab/ac，O112ab/ac和O125ab/ac。此外，還有11種OX-型。因此目前大腸桿菌O-抗原血清型共有196種[8]。

O-抗原血清型種類與大腸桿菌的致病性有一定的聯(lián)系，不同致病型大腸桿菌的優(yōu)勢O-抗原血清型不同。例如，腸出血性大腸桿菌的主要血清型為O157，E.coliO157菌株是重要的全球食源性病原菌[9]；禽致病性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O1、O2、O18和O78[10]；與尿道感染有關(guān)的大腸桿菌，其血清型主要為O1、O2、O4、O6、O7、O16、O18、O25和O75[11]；能引發(fā)新生兒腦膜炎的腸外致病性大腸桿菌菌株，其血清型主要為O18∶K1[12]；我國患病豬場分離的豬源腸外致病性大腸桿菌菌株優(yōu)勢血清型依次為O11、O8、O138、O161和O101[13]。因此，快速、準確鑒定大腸桿菌O-抗原血清型將有助于流行病學(xué)調(diào)查，疾病診斷和疫苗研發(fā)，對防御并控制致病性大腸桿菌傳播有重要意義。

1 O-抗原概述

1.1 O-抗原組成和特性 革蘭氏陰性菌外膜脂多糖由脂質(zhì)A，核心寡糖和O-抗原多糖3部分組成。脂質(zhì)A在大腸桿菌中非常保守，是毒性成分。核心寡糖區(qū)域分為內(nèi)部和外部區(qū)域，O-抗原多糖與核心寡糖外部區(qū)域的糖基相連，具有血清型特異性，由含有3-7個單糖的寡糖單位重復(fù)連接組成。單糖種類、數(shù)量、排列方式和寡糖間鏈的不同構(gòu)成了O-抗原的多樣性[6,14]。基因水平轉(zhuǎn)移是O抗原高度多樣性的主要原因。基因水平轉(zhuǎn)移、重組和點突變能使O-抗原血清型發(fā)生轉(zhuǎn)變[15-17]。此外，獲得位于細菌噬菌體或質(zhì)粒上的O-抗原修飾基因也能導(dǎo)致細菌O-抗原血清型的差異[18-19]。具有完整O-抗原的大腸桿菌為光滑型表型，而O-抗原發(fā)生突變或丟失時，大腸桿菌失去合成O-抗原的能力，為粗糙型表型[20]。

1.2 O-抗原合成基因簇 大腸桿菌中，大部分編碼O-抗原合成酶的基因在染色體上相鄰排列，形成一個約4.5 kb(O155，含有4個基因)-19.5 kb(O108，含有18個基因)的基因簇，被稱為rfb基因簇。該基因簇兩端常有持家基因galF(UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基轉(zhuǎn)化酶編碼基因)和gnd(6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶編碼基因)，在染色體上位于可拉酸合成基因簇(wca基因)和組氨酸(his基因)合成操縱子之間[21]。DebRoy等對大腸桿菌196種O-抗原合成基因簇進行序列分析，結(jié)果顯示其中有21組(46種)序列相似性高達98%～99.9%，插入元件在O-抗原合成基因簇進化過程中發(fā)揮了重要作用[8]。但O-抗原血清型O14和O57型菌株galF和gnd基因間不含有O-抗原合成基因簇[22]。

O-抗原合成基因簇中主要包括3類基因：單糖合成酶基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因和寡糖單位處理酶基因。核苷酸糖合成基因參與O-抗原核苷酸糖前體的合成，在不同O-抗原血清型中有高度相似性，且常聚集成簇[14,8]。最新研究顯示有至少27%種O-抗原血清型，核苷酸糖合成基因不位于O-抗原合成基因簇中[22]。糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移不同糖前體形成寡糖，每種O-抗原合成基因簇中含有2～6個基因編碼假定糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基轉(zhuǎn)移酶基因的點突變能導(dǎo)致O-抗原血清型間的差異[16]。O-抗原處理蛋白涉及O-抗原基本單位的轉(zhuǎn)運和聚合。

在大腸桿菌中合成O-抗原多糖的途徑為Wzy聚合酶依賴型途徑和三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運盒(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運子途徑。這兩種合成途徑中，基因wzx(糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因)/wzy(寡糖單位聚合酶編碼基因)和wzm(O-抗原ABC轉(zhuǎn)運子通透酶編碼基因)/wzt(ABC轉(zhuǎn)運子ATP-結(jié)合蛋白編碼基因)分別與O-抗原基本單元轉(zhuǎn)運和聚合有關(guān)。DebRoy等對大腸桿菌196種O-抗原合成基因簇進行分析，顯示185種基因簇中含有wzx和wzy基因，這兩個基因與運用Wzy聚合酶依賴型途徑合成和轉(zhuǎn)運O-抗原有關(guān)，另外11種O-抗原血清型(O162，O101，O89，O92，O97，O52，O95，O60，O8，O99和O9)攜帶wzm和wzt基因，利用三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運盒轉(zhuǎn)運子途徑處理O-抗原。并且依據(jù)Lguchi等對大腸桿菌182種O-抗原合成基因簇wzx/wzy或wzm/wzt同源基因序列分析結(jié)果顯示，137種O-抗原合成基因簇wzx/wzy或8種O-抗原合成基因簇wzm/wzt同源基因序列差異大，同源性<70%，具有一定的O-抗原合成基因簇特異性[8,22]。

2 O-抗原血清型分型方法

2.1 傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法 傳統(tǒng)的O-抗原血清型鑒定方法是運用特異的抗血清進行血清凝集實驗，需要從檢測樣品中分離出細菌并進行富集，將細菌于100 ℃加熱2 h釋放出表面O-抗原后，與標準O-抗原血清型細菌的特異性抗血清進行血清凝集反應(yīng)，眼觀判斷實驗結(jié)果。若菌體表面無脂多糖呈粗糙型，或者菌體發(fā)生自凝集，則不與抗血清發(fā)生凝集反應(yīng)，不能用該方法進行鑒定。如O14型菌株為粗糙型表型，與抗血清不反應(yīng)，不能進行血清學(xué)分型。此外血清學(xué)鑒定方法還受到血清質(zhì)量、血清來源、血清交叉反應(yīng)、以及菌體表面其他抗原成分的影響，使檢測準確度、檢出率和靈敏度不太理想[8, 23]。并且傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法耗時長，花費高，不利于大規(guī)模檢測。

2.2 基于特異性DNA序列的PCR分型方法 基于特異性DNA片段的PCR鑒定方法可以實現(xiàn)對生物樣品快速、準確和高效的檢測，能夠很大程度上彌補傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定方法的不足。基因wzx/wzy或wzm/wzt具有一定的O-抗原血清型特異性，常被作為PCR和芯片分析鑒定大腸桿菌O抗原血清型的靶標。依據(jù)基因wzx/wzy或wzm/wzt的特異性DNA片段，設(shè)計并篩選出不同O-抗原血清型的特異性引物，運用PCR進行大腸桿菌O-抗原血清型鑒定[24-28]。但19.8%種O-抗原血清型中wzx/wzy基因不具有特異性，或特異區(qū)域過短，無法設(shè)計引物。如O73型、O17型、O44型、O77型與O106型大腸桿菌中wzx/wzy基因的核苷酸序列同源性≥95%；wzx_O46與wzx_O134基因序列同源性為99.7%，wzx_O46基因僅在3′端區(qū)域有2 bp的缺失突變[22]。也可依據(jù)rfb基因簇中差異區(qū)域DNA序列設(shè)計引物進行PCR鑒別。例如wzx/wzy-O62與wzx/wzy-O68基因的核苷酸序列同源性>97%，O62與O68型rfb基因簇序列的差異僅在于O62中含有一個748 bp的插入元件IS1，該插入元件位于rmlA基因末端。因此為了鑒定并區(qū)分大腸桿菌O62與O68型，應(yīng)在擴增出相應(yīng)wzx/wzy基因后，再在O62型rfb基因簇IS1元件兩側(cè)設(shè)計分子標識，依據(jù)PCR產(chǎn)物大小差別區(qū)分兩種O-抗原血清型(表1)[27]。目前，根據(jù)已報道的文獻統(tǒng)計，設(shè)計并篩選出特異性引物的O-抗原血清型種類有68種，DebRoy等于2011年統(tǒng)計了58種[29]，本文補充了10種，包括O11，O12，O23，O62，O68，O116，O131，O140，O142和O163(表1)。

表1 基于大腸桿菌O-抗原合成基因簇特異序列的PCR引物
Tab.1 PCR primers based on specific sequence of E. coli O-antigen synthesis gene cluster

O-antigenserogroupTargetPrimersequencesSizeofPCRproduct(bp)ReferenceO11wzxF:GCACGCTTACTTACAC39524R:TTCCTATTAGTACTGCTwzyF:TTTGCCTCTTGCTTTA860R:TACTGCTCCGTTCTCAO12rbfregionF:ATACCGACGACGCCGATCTG23925R:GTGTCAAATGCCTGTCACCGO23wzxF:TTTTGTTTATCTTGGGCG42326R:TTTTTTCTTATGCTGCCCwzyF:TGCATAACTCTTCAGGCG402R:GCTTGGTAAGGTACGCTGO62wzxF:ATGCTGCATTAGCGTTAGCA28827R:CCTGTTGAATTGGCACGTAArmlAF:CTACACTGATGTTAGCGGGTATT1969R:CCGCTTCAAATTCAGGACAATAAO68wzxF:ATGCTGCATTAGCGTTAGCA28827R:CCTGTTGAATTGGCACGTAArmlCF:CTACACTGATGTTAGCGGGTATT1172R:CCGCTTCAAATTCAGGACAATAA表1(續(xù))O-antigenserogroupTargetPrimersequencesSizeofPCRproduct(bp)ReferenceO116wzxF:GTTTTGTCGGTAGTGTTAGG62828R:CAAGTTGGAGGAATAAGTCGwzyF:TGCTGCCCTGTTTCATTCT548R:CATAAAAGTCCGTAGCGTAGO131wzxF:TCGTGAGAAGGCTTTTTGGT29027R:CCCTATCCAATGCGCTTAAAO140wzxF:TTGGATAGCCGCGTTAATTC29427R:GCCTGAGTTAGCGGATTGAGO142wzxF:TCTCCATCCCCGTTTATTTG28527R:CCCCAAACATTAGCATTCGTO163wzyF:GCAATCTTGAAGCCAGAACC26227R:GATAAACCCAGCCACCAAA

針對O-抗原合成基因簇特異性序列設(shè)計引物進行一般PCR、多重PCR和實時PCR鑒定O-抗原血清型外[30-31]，目前還延伸至DNA芯片法和微球懸浮列陣法。

DNA芯片法是將待檢大腸桿菌O-抗原合成基因簇中基因的PCR產(chǎn)物或寡聚核苷酸點在玻璃片上，然后與帶有標簽的特異O-抗原合成基因簇長片段PCR產(chǎn)物進行雜交，依據(jù)雜交信號判斷并鑒定大腸桿菌O-抗原血清型種類。DNA芯片法已用于腸產(chǎn)毒素大腸桿菌O-抗原血清型分型[33]。DNA芯片法優(yōu)勢在于能在同一平臺上一次性鑒定多種O-抗原血清型。

磁性微球懸浮列陣法中，微球外部結(jié)合有O-抗原血清型特異性DNA序列探針，微球內(nèi)部染有不同比例紅色和紅外熒光，可以產(chǎn)生100種獨特的光譜，因此每個樣本理論上可以分析高達100種不同的結(jié)合反應(yīng)。懸浮列陣由獨特?zé)晒馕⑶蚪M成。該方法，首先提取樣品DNA為模板，用生物素標記的多種O-抗原血清型檢測引物進行多重PCR擴增，將PCR反應(yīng)產(chǎn)物變性后與微球上帶有的特異性探針進行雜交反應(yīng)，再用偶聯(lián)有強熒光藻類色素R藻紅蛋白的鏈霉素進行顯色檢測[34]。Lin等用該方法檢測了10種與產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌相關(guān)的O-抗原血清型[35]。

2.3 rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法 rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法是利用長片段PCR方法擴增出待檢大腸桿菌整個rfb基因簇后，用限制性內(nèi)切酶MboII對PCR產(chǎn)物進行酶切，通過酶切后DNA片段凝膠電泳圖譜鑒定大腸桿菌O-抗原血清型。圖譜中條帶數(shù)目為5到25條，共有147種不同O-抗原限制性片段長度多態(tài)性圖譜。但其中有13種圖譜分別對應(yīng)兩種以上O-抗原血清型[36]。此外，由于圖譜中條帶較多，不易區(qū)分，且同一條帶中可能含有多條相同大小的酶切片段，結(jié)果分析易受干擾，且該分析方法耗時較長，使得rbf-限制性片段長度多態(tài)性分析法有一定的限制性。

2.4 磁性微球免疫分析法 磁性微球免疫分析法，與上述微球懸浮列陣法都是使用Luminex技術(shù)，是一種復(fù)合微球感應(yīng)系統(tǒng)。采用該技術(shù)的分析，用微球表面共價固定的特異O-抗原血清型單克隆抗體來捕獲抗原。通過帶有生物素的二抗和紅藻蛋白報告子檢測到結(jié)合分析物。Luminex分析儀對結(jié)合分析物進行量化，從而進行多重檢測分析。微球免疫分析法的優(yōu)勢是可以同時進行多重分析，因此能夠降低檢測的費用，并且檢測時間較短，只需要3 h，此外該方法具有高靈敏度和特異性。Clotilde等利用該方法同時檢測了產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌O-抗原血清型O157、志賀氏毒素1和2，并且證實與標準的酶聯(lián)免疫吸附實驗相比，該方法有上述優(yōu)勢[37]。

2.5 基于全基因組序列預(yù)測法 SerotypeFinder在線預(yù)測工具通過收集已知O-抗原血清型大腸桿菌菌株中wzx/wzy或wzm/wzt基因序列建立數(shù)據(jù)庫，將待測大腸桿菌菌株的全基因組草圖或完整序列與數(shù)據(jù)庫中序列進行BLAST比對，利用序列相似性來預(yù)測待測大腸桿菌菌株的O-抗原血清型。該方法相比于傳統(tǒng)血清學(xué)方法更為高效，但對于不同O-抗原血清型大腸桿菌中wzx/wzy或wzm/wzt基因有高度同源性時，鑒定結(jié)果不理想，且比對wzx或wzy基因可能有鑒定結(jié)果不一致的情況[38]。

3 結(jié) 語

大腸桿菌O-抗原血清型種類繁多，而血清型種類與大腸桿菌致病型有一定的聯(lián)系。因此，實現(xiàn)大規(guī)模準確、快速、便捷鑒定O-抗原血清型將有助于流行病學(xué)調(diào)查，疾病診斷和疫苗研發(fā)，對防御并控制致病性大腸桿菌傳播有重要意義。隨著越來越多大腸桿菌基因組序列的公布和O-抗原合成基因簇的破譯，可以基于DNA序列，利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法彌補傳統(tǒng)血清學(xué)方法的不足，不斷完善O-抗原血清型鑒定方法。

目前已破譯196種O-抗原合成基因簇，但其中只有68種設(shè)計并篩選出了特異性分子標識。除去O-抗原合成基因簇序列同源性>98%的21組血清型(共46種)，還有82種O-抗原血清型特異性分子標識有待確定。O-抗原合成基因簇序列高度相似的這21組血清型(46種)中，有4組(8種)不發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，包括O2型和O50型，O46型和O134型，O118型和O151型，OX19型和O11型，可以聯(lián)合現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)血清學(xué)方法進行O-抗原血清型鑒定。O-抗原合成基因簇序列高度相似的O-抗原血清型并不發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，可能是因為抗原決定簇相關(guān)蛋白在翻譯后期進行了不同的修飾，也可能是與O-抗原免疫學(xué)反應(yīng)有關(guān)的基因位于基因組中O-抗原合成基因簇以外的位置。對于不同O-抗原血清型大腸桿菌中O-抗原合成基因簇序列同源性>98%，并且傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定又出現(xiàn)交叉反應(yīng)時，應(yīng)將這些O-抗原血清型進行融合，以免影響鑒定，包括O42型與O28ac型，O13型、O129型與O135型，O107型與O117型，O123型與O186型，O125ab型與O125ac型，O18ab型與O18ac型，OX6型與O168型，OX10型和O159型，OX21型和O163型，O38型和O128型，OX43型和O19型[8]。

大規(guī)模O-抗原血清型鑒定方法，如DNA芯片法，磁性微球懸浮列陣法，磁性微球免疫分析法和基于全基因組序列預(yù)測法等，提高了O-抗原血清型鑒定的效率和準確度，將是今后血清型鑒定發(fā)展的方向。

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Research progress on identification ofEscherichiacoliO-antigen serogroups

LIU Can-ying, ZHANG Ji-pei, WANG Bing-yun

(DepartmentofVeterinaryMedicine,CollegeofLifeScience,FoshanUniversity,Foshan528231,China)

Escherichiacolicould cause diseases under certain conditions, O-antigens contribute to the virulence ofE.coli. The chemical composition and structure of O-antigen on the surface ofE.colihave high diversity, while specific O-antigen serotype have some connections with certain pathogenicity ofE.coli. Thus, identification of O-antigen serotypes is important for epidemiological studies and control of diseases caused by pathogenicE.coli. The traditional serological typing method is time-consuming, expensive and inaccurate. With the development of science and technology, 196 O-antigen synthesis gene clusters ofE.coliwere sequenced, different O-antigen synthesis gene clusters were compared and analyzed, and molecular markers for specific DNA sequences were designed. PCR method was applied for serotyping O-antigens, including single PCR, multiple PCR, real-time PCR, DNA microarray and microbead-based suspension array. Besides, restriction of the amplified O-antigen gene cluster, microbead-based immunoassay and whole genome sequencing were also used for serotyping O-antigens. These methods would enrich the identification method ofE.coliO-antigen serogroups and make up the deficiency of traditional serological typing method. This review focuses on the research progress about O-antigen synthesis gene cluster and O-antigen serotype identification methods.

Escherichiacoli; O-antigen; serotype

Wang Bing-yun, Email: bywang63@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.010.015

王丙云，Email: bywang63@163.com

佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，佛山 528231

Q939

A

1002-2694(2016)10-0928-06

2016-04-28；

2016-08-12

廣東普通高校青年創(chuàng)新人才項目(No.2015KQNCX173)

Supported by the project of the Young Creative Talents in Universities in Guangdong Province (No. 2015KQNCX173)