?撰稿 朱濤

論壇

重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝特點和技術創新

?撰稿 朱濤

朱濤，天津科技大學教授，國家千人計劃入選者。1998年獲清華大學化學工程碩士學位，2002年獲美國匹茲堡大學生物化學工程博士學位。2002-2004年在美國卡內基梅隆大學從事博士后研究；2004-2005年在芝加哥 IntegratedGenom?ics Inc任職科學家，從事生物信息學和代謝工程的研究；隨后加入世界疫苗巨頭——賽諾菲巴斯德(Sanofi Pasteur)從事疫苗開發。2009年回國創辦天津康希諾生物技術有限公司，專業從事疫苗及其他生物制品的開發，任公司研發副總、首席科學家。

埃博拉病毒病（Ebola virus disease，EVD），是迄今發現的感染性最強的傳染性疾病之一。埃博拉病毒屬分5個亞種，即埃博拉-扎伊爾型（EBO-Zaire）、埃博拉-蘇丹型（EBO-Sudan）、埃博拉-萊斯頓型（EBO-Reston）、埃博拉-科特迪瓦型（EBO-tai forest）和本迪布焦型（EBO-bun?dibugyoe）[1]。不同亞種具有不同的特性，EBOZaire和EBO-Sudan對人類和非人類靈長類動物的致病性和致死率很高；2014年西非爆發的埃博拉疫情就是EBO-Zaire引起的。EBO-Reston對人類不致病，對非人類靈長類動物具有致死性作用；EBO-tai forest對人類有明顯的致病性，但一般不致死，對黑猩猩的致死率很高。

目前沒有有效的藥物可以治療埃博拉感染性疾病，WHO推薦的治療原則是口服或靜脈補液以維持電解質平衡，維持血壓，控制體溫和治療并發癥等綜合措施，但是這些治療的主要目標是阻止或者緩解疾病所造成的損傷，減輕病痛，臨床效果一般。通常采取快速大規模的隔離、針對死者的安全深埋和輔助治療等措施綜合來控制埃博拉爆發流行。開發有效針對埃博拉病毒的疫苗對于防治病毒的再次爆發流行有重要的作用。

我國研發的埃博拉疫苗采用重組腺病毒載體技術，是本輪流行期國際上第3個進入臨床研究的埃博拉疫苗，也是我國第一個在國外進行臨床研究的疫苗。本文嘗試綜述重組腺病毒載體埃博拉疫苗的工藝、產品特點，為同類疫苗的研發提供思路。

1 重組腺病毒載體埃博拉疫苗的放大及凍干工藝研究

用于重組腺病毒載體埃博拉疫苗生產的HEK293SF-3F6細胞為加拿大國家科學理事會（National Research Council Canada，NRC）開發的可在無血清培養基中懸浮培養生產病毒載體和重組蛋白的細胞株。相比較傳統的HEK293細胞，該細胞株的主要優勢是以無血清培養基作為生長條件，適應懸浮培養，無需微載體，可以直接放大生產，細胞培養工藝簡單。NRC在GMP條件下建立原代細胞庫，細胞株的來源清楚，馴化過程均有詳細和完整的實驗記錄，并且進行了全方位的檢定。符合GMP要求，可用于人用疫苗生產。康希諾公司于將NRC引進的HEK293SF-3F6細胞株作為原代，在GMP條件下復蘇該細胞株，建立主細胞庫和工作細胞庫，并獲得中檢院的合格檢定報告。

重組腺病毒載體埃博拉疫苗小試發酵工藝采用搖瓶培養的方法，由于生產用的細胞株已經適應懸浮培養，因此200mL小試規模參數的探索相對容易。從搖瓶培養，經7.5 L發酵罐的放大，到50 L發酵放大，再到目前的200 L發酵工藝，逐步實現發酵工藝的放大。細胞在發酵罐中的懸浮高密度培養是病毒疫苗和抗體生產過程中最難克服的關鍵工藝之一。實現細胞在不同發酵規模下的高密度培養，需要解決如何合理的控制溶氧，細胞生長代謝過程中會產酸，培養基pH的調節采用什么試劑，如何確定合理的pH范圍從而保證細胞的生長速度快。由于發酵罐有攪拌槳，那么攪拌過程中的剪切力對細胞生長的影響如何消除等等，只有解決這些技術才可以實現細胞懸浮高密度的培養。目前重組腺病毒載體埃博拉疫苗采用一次性反應器的生產技術，已經實現200 L發酵規模的生產。

同理，病毒感染過程中需要確定最佳的感染時間，最佳的感染量（MOI），病毒感染后在病毒繁殖期間，維持細胞生長所需要的最佳pH、最佳溶氧以及降低攪拌槳對細胞活性的影響。病毒感染后什么時候收獲細胞可以使病毒的產量最高。每一個因素都影響最后回收樣品的病毒滴度（IFU）。從200mL的搖瓶工藝開始就探索每一個參數，7.5 L和50 L發酵規模放大的時，基于小試工藝參數進行再次優化，最終實現200 L規模下高表達的病毒生產工藝。

重組腺病毒載體埃博拉疫苗的純化，需要實現三個目的：第一，疫苗的純度大于90%，一般為95%，無多聚體。第二，殘余DNA和蛋白質的含量滿足中國藥典的要求。第三，原液可在緩沖液中穩定保存，既不聚集也不降解。原則上最佳的純化工藝是步驟相對少，回收率相對高。小試純化工藝研究中，我們嘗試個多個不同的填料，不同的填料組合，不同的緩沖液和洗脫條件，最終確定采用先通過Sepharose Q HP去除蛋白/核酸和細胞碎片，然后經過 Capto Core 700進行病毒的精純；中試放大中進一步優化了最佳上樣量，確定了洗脫條件和樣品的收集范圍，經過多批次的研究結果證明，通過兩步純化工藝得到的腺病毒純度高達95%。埃博拉疫苗原液保存的緩沖液的選擇最為關鍵，是直接影響病毒活性和純度的關鍵輔料。以DOE軟件設計多種原輔料組合，通過測定37℃加速和2～8℃長期穩定性研究中腺病毒IFU和純化的變化，最后確定適合保存埃博拉疫苗原液的最佳配方。

重組腺病毒載體埃博拉疫苗為凍干制劑，是世界上的第一個重組埃博拉疫苗凍干制劑，可在2～8℃長期保存，在37℃下暴露2周，活力不降低。凍干制劑的開發需要解決一系列技術難題，如何減少凍干前后腺病毒活力的降低，如何減少凍干過程中病毒聚集，如何合理設計凍干曲線從而保證疫苗的水分符合要求，并使產品具有較好的長期穩定性，如何原輔料的配伍，以及如何保證凍干制劑的外觀符合要求，且加入稀釋劑后可快速溶解等一系列難題。此外還需要探索凍干樣品從小試，到中試放大過程中，凍干曲線是否合適，前期小試確定的凍干工藝參數是否適合中試放大，中試規模最佳的凍干曲線和制劑生產工藝。經過一系列實驗，最終實現30 000劑/批的成品生產。

在WHO組織的有關埃博拉疫苗主題討論中，該制劑工藝贏得同行的贊賞。同期在非洲開展臨床實驗的以黑猩猩3型腺病毒為載體構建的埃博拉疫苗（葛蘭素史克公司）保存在-80℃，而為了有效保證-80℃冰箱的正常工作，GSK特異配備發電設備，且有專人24 h值班，而且實驗疫苗的來回運輸也是頗費周折。而重組腺病毒載體埃博拉疫苗則可保存在常規冰箱，來回運輸通過常規的冷藏箱即可實現，非常便利，受到塞拉利昂藥材局長和衛生部長的高度認可。

2 重組腺病毒載體埃博拉疫苗有效克服預存免疫

以5型腺病毒為載體開發疫苗，最大的擔憂就是預存免疫有可能會影響疫苗的臨床效果；臨床試驗結果表明增加免疫劑量或者采用加強免疫均可有效避免預存免疫對埃博拉疫苗免疫效果的影響。

Ⅰ期臨床研究發現，75%～85%受試者體內具有5型腺病毒的中和抗體，而55%～63%受試者體內具有更高滴度的腺病毒中和抗體；臨床研究結果表明，受試者體內的腺病毒中和抗體可以減弱疫苗激發的抗GP糖蛋白特異性的抗體反應，但是低劑量組更為明顯；總之，增加免疫劑量可有效避免預存免疫對埃博拉疫苗的影響[2]。

無論是高劑量組，還是低劑量組，初免受試者體內均產生有效的免疫反應，但是從28天抗GP蛋白抗體滴度達到高峰之后，抗體滴度開始下降，至6月時抗體滴度下降到較低的水平。初免6月后以相同的疫苗和劑量進行加強免疫，結果表明，無論加強免疫時受試者體內抗5型腺病毒中和抗體水平的高低，兩個劑量組，加強免疫后都產生很強的抗GP蛋白的抗體反應，抗GP蛋白抗體滴度遠高于初次免疫時的抗體滴度；提示重組埃博拉疫苗通過加強免疫也可有效克服預存免疫對疫苗的影響[3]。

3 重組腺病毒載體埃博拉疫苗技術應用展望

重組埃博拉病毒載體疫苗采用腺病毒載體技術，腺病毒載體疫苗既可誘導體液免疫，也可以誘導細胞免疫，無需佐劑，可以通過肌肉注射或者粘膜免疫，是非常理想的疫苗載體。腺病毒載體疫苗廣泛應用于各種預防性和治療性疫苗的開發，包括艾滋病、流感、塞卡病毒病、乙肝、HPV感染、前列腺癌、丙肝、狂犬病及結核病的疫苗，是目前最有應用前景的疫苗載體之一[4]。

據saranya Sridhar的統計，截至2015年，有15個不同的埃博拉疫苗處于臨床前藥效學研究階段，8個疫苗處于不同的臨床階段。這8個處于臨床階段的埃博拉疫苗，除了1個為VLP蛋白疫苗，一個為DNA疫苗外，其余6個均為病毒載體疫苗，其中3個均為腺病毒載體疫苗[5]。

腺病毒作為平臺技術高表達、易于生產、質量可控；公司建立的腺病毒載體平臺技術可實現應急疫苗的快速研發和制備，該平臺技術已經應用于結核病，馬爾堡和寨卡疫苗的開發。基于腺病毒載體技術平臺開發的重組結核病疫苗已經在加拿大完成臨床I期研究，正在進行粘膜免疫（噴霧給藥）。口服制劑或者粘膜給藥技術的研發，包括生物礦化，將極大增強腺病毒平臺技術的適用性；為更多新型疫苗的開發提供新的技術途徑。

參考文獻

[1]李昱,任翔,劉翟,等.埃博拉病毒病流行病學、生態學、診斷、治療及控制[J].科學導報,2014,32 (24):17-26.

[2]Zhu F C,Hou L H,Chen W,et al.Safety and im?munogenicity of a novel recombinant adenovirus type-5 vector-based Ebola vaccine in healthyadultsin China:preliminary reportofa randomised,doubleblind,placebo-controlled,phase 1 trial[J].Lancet, 2015,385(9984):2272-2279.

[3]Li J X,Hou L H,Chen W,et al.Immunity dura? tion of a recombinant adenovirus type-5 vectorbased Ebola vaccine and a homologous prime-boost immunisation in healthy adults in China:final report ofa randomised,double-blind,placebo-controlled, phase 1 trial[J].Lancet Glob Health,2017,5(3):e324-e334.

[4]楊勇,周東明.腺病毒載體疫苗的臨床研究進展[J].生命的化學,2014,34(1):46-51.

[5]Sridhar S.Clinical development of Ebola vaccine[J].Ther Adv Vaccines,2015,3(5-6):125-138.

（特邀編輯：侯利華）

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.01.003