天麻HPLC指紋圖譜建立及判別分析

肖佳佳+黃紅+雷有成+林廷文+馬越+張靜+張興國+張大全+呂光華

[摘要] 天麻為常用名貴中藥，使用量大、價格高，常有性狀相似的偽品出現；并且冬天麻（栽培天麻）與春天麻（多為野生天麻）的價格差異較大，真偽優劣難以鑒別。為此，廣泛收集了48份冬天麻、春天麻、天麻飲片、天麻粉等不同性狀的天麻樣品和9種10份天麻偽品，應用HPLC-DAD-MS技術，通過優化供試液的制備方法、色譜條件和質譜條件，測定、比較這些樣品的HPLC圖，并進行相似度及Fisher判別分析。結果表明，這48份天麻樣品的HPLC圖相似，其相似度大于0.848（n=48）；以其平均圖譜作為指紋圖譜。有11個分離良好的共有峰，選擇6個主要色譜峰作為特征峰，經與對照品比較，UV和MS數據分析，分別鑒定為天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E，均為天麻的藥效成分。10份天麻偽品與天麻HPLC指紋圖譜明顯不同，相似度低于0.042，并且未發現天麻HPLC指紋圖譜的特征峰。說明根據指紋圖譜的相似度或者特征峰均可鑒別天麻的真偽。對15份冬天麻和11份春天麻的HPLC圖分析結果表明，兩者的HPLC圖相似（平均相似度為0.908）；但特征峰的強度不同，冬天麻中天麻素、巴利森苷A和C的強度低于春天麻；以天麻HPLC圖中11個共有峰的面積為變量建立的Fisher非標準化判別函數和線性判別函數均能100%判別冬天麻和春天麻，予以準確鑒別。

[關鍵詞] 天麻；冬天麻；春天麻；HPLC；指紋圖譜；鑒別；判別分析

[Abstract] Tianma（the tuber of Gastrodia eleta） is a widely used and pricy Chinese herb. Its counterfeits are often found in herbal markets， which are the plant materials with similar macroscopic characteristics of Tianma. Moreover， the prices of Winter Tianma（cultivated Tianma） and Spring Tianma（mostly wild Tianma） have significant difference. However， it is difficult to identify the true or false， good or bad quality of Tianma samples. Thus， a total of 48 Tianma samples with different characteristics（including Winter Tianma， Spring Tianma， slice， powder， etc.） and 9 plant species 10 samples of Tianma counterfeits were collected and analyzed by HPLC-DAD-MS techniques. After optimizing the procedure of sample preparation， chromatographic and mass-spectral conditions， the HPLC chromatograms of all those samples were collected and compared. The similarities and Fisher discriminant analysis were further conducted between the HPLC chromatograms of Tianma and counterfeit， Winter Tianma and Spring Tianma. The results showed the HPLC chromatograms of 48 Tianma samples were similar at the correlation coefficient more than 0.848（n=48）. Their mean chromatogram was simulated and used as Tianma HPLC fingerprint. There were 11 common peaks on the HPLC chromatograms of Tianma， in which 6 main peaks were chosen as characteristic peaks and identified as gastrodin， p-hydroxybenzyl alcohol， parishin A， parishin B， parishin C， parishin E， respectively by comparison of the retention time， UV and MS data with those of standard chemical compounds. All the six chemical compounds are bioactive in Tianma. However， the HPLC chromatograms of the 10 counterfeit samples were significantly different from Tianma fingerprint. The correlation coefficients between HPLC fingerprints of Tianma with the HPLC chromatograms of counterfeits were less than 0.042 and the characteristic peaks were not observed on the HPLC chromatograms of these counterfeit samples. It indicated the true or false Tianma can be identified by either the similarity or characteristic peaks on HPLC fingerprint. Comparing the Winter Tianma with Spring Tianma showed that the HPLC chromatograms of 15 winter Tianma samples and 11 spring Tianma samples were similar at the mean correlation coefficient of 0.908. But the intensity of the characteristic peaks were different between the two groups of Tianma samples， i.e. the intensity of gastrodin， paishin A and C in winter Tianma was lower than those in spring Tianma. The Winter Tianma and Spring Tianma could be discriminated by either the Fisher unstandardized discrimination function or Linear discriminant function， based on the peak areas of 11 common peaks on HPLC chromatograms as variate.

[Key words] Tianma；Winter Tianma；Spring Tianma；HPLC；fingerprint；identification；discriminant analysis

天麻為常用的名貴中藥，來源于蘭科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥塊莖；具有息風止痙、平肝潛陽、祛風通絡的功效[1]，被譽為“治風之神藥”，對中樞神經系統、心血管系統、免疫系統等多個系統具有藥理作用[2-7]。天麻還是我國衛生部規定的可用于保健食品的原料，并在日常生活中作為滋補品食用。因其使用量大、價格高，常有多種形似天麻的其它植物塊莖、球莖、根莖、塊根等充當天麻。同時，天麻根據采收時間不同，分為冬天麻（冬季采收）和春天麻（春季采挖）2種。冬天麻為人工栽培，是天麻的主流商品。春天麻多為“野生天麻”，少數為人工栽培天麻冒充野生天麻銷售。在商品市場上，野生天麻的價格高于人工栽培天麻。根據性狀特征，對天麻的真偽、優劣難以鑒別。為此，本研究基于天麻的特征性化學成分，建立天麻真偽優劣鑒別的指紋圖譜和判別方法。

關于天麻的指紋圖譜，已有多篇文獻報道，涉及產地、家種與野生天麻的鑒別等[8-11]。但存在天麻樣本量小，代表性不強；或選擇的共有峰太多，特征性不強，適用性差；并缺乏偽品驗證等不足。天麻的生物活性成分主要為天麻素和對羥基苯甲醇等酚類成分，以及由天麻素和檸檬酸縮合而成的巴利森苷成分[12-14]。本研究立足于天麻的生物活性成分，從不同產地、生產企業和中藥材市場收集了48份不同來源及性狀的天麻樣品（包括15份冬天麻、11份春天麻、1份收集過種子的天麻塊莖、10份天麻飲片、7份天麻粉和4份冷凍干燥天麻），還收集了9種共10份常見的天麻偽品，應用HPLC-DAD-MS技術，通過優化供試液制備方法、色譜條件和質譜條件，對比分析天麻正品與偽品圖譜特征，建立了反映天麻藥用特性的HPLC指紋圖譜。并通過對冬天麻與春天麻的化學成分比較，建立兩者的Fisher判別函數式。以期為天麻的真偽鑒別和質量評價提供準確、客觀、適用的方法。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國，配置G1322A真空在線脫氣機，G1311A四元梯度泵，G1329B自動進樣儀，G1316A柱溫箱，G1315C二極管陣列檢測器）；Agilent LC - QQQ - MS液質聯通儀（ESI離子源）；BSA224S型電子天平（d=0.1 mg）和BP211D型電子天平（d=0.01 mg）（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；KH-250DB型數控超聲波清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）。

《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004版A版）和SPSS 19.0統計分析軟件用于HPLC圖譜的相似度評價和主成分分析。

1.2 藥品及試劑

天麻素（批號11807-200205，中國食品藥品檢定研究院）；對羥基苯甲醇（批號H20806，美國Sigma-aldrich公司）；巴利森苷A（parishin A，批號13122302），巴利森苷B（parishin B，批號13122013），巴利森苷C（parishin C，批號13122012）和巴利森苷E（parishin E，批號1-1011606）均購于成都普瑞法科技開發有限公司；乙腈為色譜純（美國Sigma-aldrich公司）；甲醇、磷酸、甲酸均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）；冰乙酸為分析純（天津博迪化工股份有限公司）；超純水由優普超純水制造系統（四川優普超純科技有限公司）制備。

1.3 藥材

48份天麻樣品均為蘭科植物天麻G. elata的干燥塊莖或其加工品，包括15份冬天麻，11份春天麻，1份采收過種子的天麻塊莖，10份天麻飲片，7份天麻粉，4份凍干天麻（表1）。此外，還收集了9種常見天麻偽品10份樣品（表2）。所有樣品均由成都中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室呂光華教授鑒定。

2 方法

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱為Alltima C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A） -0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～11 min，3～5% A；11～18 min，5% A；18～31 min，5～14% A；31～38 min，14% A；38～48 min，14～20% A；48～55 min，20～24% A；55～75 min，24～80 % A）；流速1.0 mL·min^-1；柱溫35 ℃；檢測波長220 nm；進樣量10 μL。在LC-MS系統中，流動相以0.1%甲酸溶液替代0.1%磷酸溶液，其余色譜條件相同。

2.2 質譜條件

電離源模式：電噴霧離子化；電離源極性：負模式和正模式；霧化氣：氮氣；霧化氣壓力275.8 kPa；掃描方式：負離子、正離子掃描；掃描模式：多反應監測；電噴霧電壓4 000 V；離子源溫度300 ℃；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量6.0 L·min^-1。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E對照品適量，置于10 mL量瓶中，加60%甲醇定容至刻度，搖勻；經0.22 μm微孔濾膜過濾，得到混合對照品溶液。

2.4 供試液的制備

精密稱取樣品粉末（過50目篩）2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入60%甲醇25 mL，稱重；超聲（100 W，40 kHz） 提取60 min，冷卻，再稱重，加60%甲醇補足失重，搖勻；經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得測定HPLC圖的供試液（圖1）。

2.5 樣品HPLC圖的測定

每份樣品的粉末稱取2份，平行制備供試品溶液，測定HPLC圖。如果2份平行供試液的圖譜相似，特征峰的相對峰面積（峰面積除以樣品質量）差異少于5%，則任選其中1份HPLC圖作為該藥材樣品的圖。如果2份平行供試液HPLC圖特征峰的相對峰面積之間的差異大于5%，則重新制備1份供試液，測定；在2份HPLC圖峰面積相近的圖譜中，選擇1份作為該藥材樣品的HPLC圖。

2.6 HPLC圖的處理

將藥材樣品的HPLC圖以AIA格式導出，再分別導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》計算機軟件分析。時間窗寬度為0.10 min，剪切前5 min的溶劑峰，采用多點校正。

2.7 方法學驗證

在天麻的HPLC圖中，有11個主要峰分離良好。故以這11個峰的保留時間和峰面積為指標，進行方法學考察。

2.7.1 精密度 取同一份天麻供試液（S19），連續進樣測定6次。11個峰保留時間的RSD為0.020%～0.86%（n=6），峰面積的RSD為0.88%～2.9%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.7.2 穩定性 取同一份天麻供試液（S19），于制樣后0，2，4，8，12，24 h分別進樣測定HPLC圖。11個峰保留時間的RSD為0.020%～1.1%（n=6），峰面積的RSD為1.1%～3.0%（n=6）。表明天麻供試液在24 h內穩定。

2.7.3 重復性 取同一份天麻樣品（S19）粉末，稱取6份。平行制備供試液，測定HPLC圖。11個峰保留時間的RSD為0.20%～0.60%（n=6），相對峰面積（峰面積除以樣品的質量）的RSD為0.53%～3.0%（n=6）。表明方法重復性良好。

3 結果與討論

3.1 HPLC色譜峰的鑒定

在48份不同性狀天麻的HPLC圖中，11個共有峰的分離良好。通過與對照品的保留時間、UV光譜比較，并分析MS數據，鑒定了6個主要色譜峰（圖1，表3）。在MS譜中，這6個峰均出現[M+H]+或[M-H]-分子離子峰。天麻素的主要碎片離子峰m/z 125.9，為失去1分子葡萄糖的碎片。對羥基苯甲醇的主要碎片離子峰m/z 104.3，為失去1個羥基的碎片。巴利森苷E，B，C，A為天麻素與檸檬酸縮合而成，均有碎片離子峰m/z 138.6，為這些化合物失去天麻素和羥基的碎片。

3.2 天麻的真偽鑒定

3.2.1 天麻HPLC指紋圖譜的建立 不同產地、不同加工方法、不同性狀的27份天麻藥材、10份天麻飲片、7份天麻粉和4份凍干天麻的HPLC圖的整體峰形一致，相似度為0.848～0.994（表1），平均相似度為0.958（n=48）；有11個共有峰。表明這48份天麻的化學成分相近。利用平均數法，計算它們平均圖譜，作為天麻的HPLC指紋圖譜（圖2）。

根據色譜峰的強度和文獻報道天麻的生物活性成分，選擇6個主要色譜峰作為天麻真偽鑒別指紋圖譜的特征峰，分別為天麻素，對羥基苯甲醇，巴利森苷E，巴利森苷B，巴利森苷C，巴利森苷A。這6種成分均有生物活性，反映天麻的藥用性質。以天麻素為參照峰，計算出其余5個特征峰的相對保留時間和相對峰面峰面積（表4）。

3.2.2 與天麻偽品的鑒別 天麻為常用的名貴中藥，使用量大，價格較高，時常有形狀相似的偽品出現。為此，本研究收集了9種常見的天麻偽品，共計10份樣品（表2）。與天麻的指紋圖譜比較，這些偽品的HPLC圖與天麻差異明顯（圖3），其相似度僅為0.004～0.042（表2），顯著低于48份天麻樣品的最低相似度（0.848）。并且，均未發現天麻HPLC指紋圖譜中的6個特征峰。由此可見，根據天麻HPLC指紋圖譜的相似度或者特征峰，天麻與偽品均能予以鑒別。同時也表明，偽品天麻與正品天麻的化學成分明顯不同。如果誤用或混用，不僅不能治病，還可能出現毒副作用。

3.3 冬天麻與春天麻的鑒別

根據采收時間的不同，天麻分為冬天麻（冬季采挖的天麻）和春天麻（春季采挖的天麻）兩種。冬天麻為人工栽培，又稱為“栽培天麻”，為天麻的主流商品。春天麻多為“野生天麻”，其次為人工栽培天麻冒充野生天麻銷售。在中藥商品市場上，野生天麻的價格高于人工栽培天麻。為此，本研究收集了15份冬天麻和11份春天麻，比較HPLC圖和化學特征。

3.3.1 冬天麻與春天麻HPLC圖比較 冬天麻與春天麻HPLC圖的整體峰形相似，其平均相似度為0.908；且均有11個共有峰（圖4）。比較這11個共有峰發現，冬天麻中這11個共有峰的相對峰面積（峰面積除以樣品的質量）之和（16 185，n=15）低于春天麻（20 172，n=11），為80.2%。冬天麻各個共有峰的相對峰面積的變異幅度大于春天麻，尤其是峰3、4（天麻素）、5（對羥基苯甲醇）和11（巴利森苷A）的變化幅度較大（圖5）。

比較天麻HPLC指紋圖譜中6個特征性成分（均為生物活性成分）發現：從整體峰形看，以天麻素為參照峰，冬天麻中其余5個特征峰的強度均略高于春天麻（表5），也說明冬天麻中天麻素的含量在6個特征峰中相對較低。從特征峰的面積看，冬天麻中6個特征峰的總面積（峰面積與樣品質量之比值）略低于春天麻，為85.6%。其中，冬天麻中天麻素、巴利森苷C和A的峰面積均低于春天麻（表6）。表明冬天麻中已知活性成分的含量略低于春天麻。但是，根據天麻HPLC指紋圖譜的相似度和特征峰的強度，難以鑒別未知樣品為冬天麻，還是春天麻。

3.3.2 冬天麻與春天麻Fisher函數判別 Fisher判別分析是根據兩類對象若干指標的觀測結果，判定其所屬類別的一種統計方法。其基本思想是先根據類間距離最大、類內距離最小的原則確定線性判別函數，再用此函數判定待判樣品的類別[15]。據此，本研究以天麻HPLC圖中11個共有峰的面積為變量（X1～11），建立了冬天麻與春天麻的Fisher判別函數。在26份天麻塊莖樣品中，隨機抽取的4份樣品（S3，S4，S18和S24）為驗證樣本；其余22份天麻樣品（S1，S2，S5～S17，S19～S23，S25，S26）為模型樣本，進行SPSS判別分析。當P=0.000時，表明該Fisher判別函數具有統計學意義。

22份天麻已知樣品的非標準化Fisher判別函數為Y=0.075X₁+0.032X₂-0.002X₃-0.001X₄-0.002X₅+0.002X₆-0.002X₇+0.008X₈+0.007X₉-0.013X₁₀+0.001X₁₁-27.602。該函數判別規則為：Y<0，則為冬天麻；Y>0，則為春天麻。將上述4份天麻驗證樣本的11個共有峰的峰面積代入函數計算。YS3 和YS4分別為-3.169和-5.469，均<0，則判別為冬天麻；YS18和YS24分別為1.962和1.680，均>0，則判別為春天麻。該判別結果與實際情況相符，符合率達100%。

同時，22份天麻模型樣本得到的Fisher線性判別函數。

將上述4份天麻驗證樣本的峰面積分別代入冬天麻和春天麻的判別式中，計算判別函數Y值，比較Y₁與Y₂值的大小，哪個值大就將判別對象判為哪一類。4份天麻驗證樣本的計算值和判別結果（表7）。其符合率達100%。由此可見，運用Fisher判別分析，可以鑒別冬天麻與春天麻。

3.4 方法學優化

3.4.1 色譜條件的選擇 在文獻報道中，多采用270 nm作為天麻HPLC的檢測波長[16-17]。本研究HPLC-DAD在線檢測結果表明，有11個峰分離良好；除峰1外，其余10個共有峰的最大吸收波長均在220 nm處左右。并且，各共有峰在220 nm處檢測的峰面積為270 nm處檢測峰面積的6.6～16.4倍。故本研究選擇220 nm為檢測波長。

本實驗分別考察了乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%甲酸水和乙腈-0.1%冰乙酸水3種溶劑系統為流動相的分離效果。在220 nm處檢測，乙腈-0.3%甲酸水和乙腈-0.1%冰乙酸水2種系統為流動相的基線不平穩。故選用乙腈-0.1%磷酸水為流動相。

3.4.2 提取溶劑的選擇 由于天麻中各種生物活性成分的極性較大；如果提取溶劑中甲醇濃度過高，則影響提取效率；如果甲醇濃度過低，則糖類等水溶性成分的大量溶出會影響供試液的過濾。為此，本研究比較了40%，50%，60%，70%，80%甲醇的提取效果。結果表明，在60%甲醇提取的供試液中，11個共有峰的面積之和最大；并且，提取液容易過濾。故選用60%甲醇為提取溶劑。

由于中藥多以水為煎煮溶劑，天麻的食用量較大；本實驗進一步比較了60%甲醇與水的提取效果。結果表明：在兩者的提取液中均檢出這11個共有峰，而水提液中這11個共有峰的面積僅為60%甲醇提取液的12%～94%；說明60%甲醇的提取效果更好。

3.4.3 提取方法的選擇 比較了天麻超聲提取和回流提取制備的兩種供試液的HPLC圖。結果表明，兩者的主要峰相同，共有峰的強度相近，圖譜相似度達0.997。由于超聲提取的操作簡便、快速，可同時提取多份樣品，故被本研究采用。

3.4.4 質譜源內碎裂電壓的優化 為了使分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度達到最大，根據天麻中化合物的結構，優化了源內碎裂電壓。采用程序升壓為0～22 min，80 V；22～35 min，100 V；35～55 min，180 V。同時，天麻素在負離子模式下難以電離，呈現倒峰；而在正離子模式下，檢測到分子離子峰和特征性碎片峰。

4 結論

天麻為常用的名貴中藥，摻雜及偽品較多。本研究從不同產地、生產企業和中藥材市場收集、測定了48份不同性狀特征和加工方法的天麻塊莖、飲片及天麻粉，并與9種10份常見的天麻偽品比較，由此建立的天麻HPLC指紋圖譜，反映了天麻的化學信息。并且，本實驗選擇HPLC圖中6個主要的、有生物活性的成分為特征峰，反映了天麻的藥用作用。由此建立的指紋圖譜的特征性強，實用性高，根據圖譜的相似度或者特征峰，均能鑒別天麻的真偽，有利于保證天麻的真實性以及中醫藥的臨床療效。

同時，由于冬天麻（栽培天麻）與春天麻（多為野生天麻）的價格差異較大，通過對15份冬天麻和11份春天麻的對比研究，明確了兩者化學成分的差異。經統計分析建立的兩種Fisher判別式，均能客觀、準確地判別冬天麻與春天麻，有利于保證天麻的優質優價，貨真價實。

[致謝] 四川新荷花中藥飲片公司，四川中藥飲片有限公司，四川蜀科藥業有限公司提供部分天麻樣品。

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[責任編輯 丁廣治]